2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of novel microRNA detection system
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16K14027
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| Research Institution | National Defense Medical College |
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Principal Investigator |
武井 史恵 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 進学課程, 准教授 (30252711)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | PCR / miRNA / 蛍光分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本提案ではPCRを基盤とした簡便、高感度なmiRNA検出法の開発を主目的とし、HP-PCR法を使ったmiRNA検出法を開発する。この方法を実用的な技術に仕上げするために、下記３つの目標を設定した。1) RT-HP-PCR法を使ったmiRNA検出法の構築、2) DNAプローブを用いた蛍光増大型HP-PCR法（Hpro-PCR法）とmiRNA検出法の開発、3)新規蛍光分子の開発によるHP-PCR法、Hpro-PCR法の高性能化。本年度は主に3) 新規蛍光分子の開発によるHP-PCR法、Hpro-PCR法の高性能化をおこなった。28年度に我々が開発したHP-PCR法を使ってmiRNAの検出を行なうと、miRNAが検出可能であることが確認できた。また蛍光増大型のHpro-PCR法も、miRNAの検出に応用できるのでないかと考え、HPro-PCR法はDNAの特殊構造を構築できるヘアピン型DNAプローブを設計し、PCRのプライマーの5’末端にそのプローブと相補的なDNAタグをつけ、PCR前にはそのヘアピン型プローブが開いた形になっている。PCRが進行するに従い、DNAプローブはタグは配列から剥がされ、剥がされたタグは自発的にヘアピン構造をとる。DNAの特殊構造に特異的に水素結合する蛍光分子DANPがそのヘアピンに結合すると蛍光が発せられ、PCRの進行がモニタリングできる。実際にOne-step RT-PCRキットを使って逆転写からPCRまでを連続して行うと蛍光強度変化が観測され、この方法で簡単にmiRNAの検出ができることが示唆された。また、プライマーのタグは、プライマーとテンプレートがアニーリングされるときにも大きく寄与しており、タグがない場合はPCRが進行しないことが明らかとなった。
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