2016 Fiscal Year Research-status Report
水素結合および金属配位結合により対合する人工塩基対を用いたＤＮＡ鎖交換反応の開発
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16K14029
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
竹澤 悠典 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (70508598)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | DNA / 人工DNA / 金属錯体型塩基対 / DNA鎖交換反応 / 金属錯体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、(1)天然核酸塩基と水素結合を介したワトソン-クリック型塩基対を形成し、かつ、金属イオン存在下では配位結合により対合して金属錯体型非天然塩基対を形成する「ヤヌス型人工核酸塩基」の創製、および (2)「水素結合型天然塩基対」と「金属錯体型人工塩基対」と間の可逆な変換に基づくDNAの鎖交換反応の開発を目的としている。
本年度は、チミンの5位メチル基を水酸基に置換した5-ヒドロキシウラシル(UOH)に着目し、金属錯体形成に基づくDNA鎖交換反応を検討した。UOH塩基はアデニン(A)塩基と水素結合型塩基対UOH-Aを形成する一方で、Gd(III)イオン等の金属イオン存在下で金属錯体型塩基対UOH-Gd(III)-UOHを形成する。そこで中央に3個のUOH塩基を含む互いに相補的なDNA鎖(1U, 2U)、およびUOHの代わりにAを含むDNA鎖(2A)を用いて、Gd(III)イオンの添加によるDNA鎖交換反応の追跡を行った。3本のDNA鎖(1U, 2U, 2A)を混合・アニーリングしたところ、金属イオン非存在下ではUOH-A塩基対を含む二重鎖1U・2Aが選択的に形成した。一方、3当量のGd(III)イオン存在下では、約40％が二重鎖1U・2Uを組むことが分かった。これはUOH-Gd(III)-UOH塩基対の形成によるものと考えられる。同様に、中央に4個のUOHを含むDNA鎖(3U, 4U)、およびAを含むDNA鎖(4A)を用いたところ、Gd(III)イオンの添加により最大で約80％の効率で二重鎖3U・4Uを形成することを見出した。さらに、30℃の等温条件で二重鎖形成を評価したところ、Gd(III)イオンの添加後約20時間で鎖交換反応が約80％進行することを見出した。さらにキレート剤であるEDTAによりGd(III)イオンを取り除くことで、逆反応が進むことも確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
水素結合型天然塩基対と金属錯体型人工塩基対との間の可逆な変換に基づくDNA鎖交換反応の実現を目指し、本年度は5-ヒドロキシウラシル(UOH)塩基を導入したDNA鎖を用いて検討を行い、以下の結果を得た。
(1)融解温度測定およびポリアクリルアミドゲル電気泳動による二重鎖形成評価から、金属イオン非存在下ではUOH-A塩基対を含む二重鎖が選択的に形成し、Gd(III)イオン存在下ではUOH-Gd(III)-UOH塩基対を含む二重鎖形成が誘起されることを見出した。
(2)等温条件下においても、Gd(III)の添加による鎖交換反応が進行することを見出した。
(3)キレート試薬であるEDTAを加えてGd(III)を除去することで、逆向きの鎖交換反応が進むことを確かめた。
以上のように、UOH-A塩基対とUOH-Gd(III)-UOH塩基対の変換により、DNA鎖交換反応を誘起できることを見出した。等温下での鎖交換反応には時間がかかるなどの課題はあるが、金属イオンを外部刺激とする鎖交換反応の進行が見られ、おおむね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、5-ヒドロキシウラシル(UOH)塩基を導入したDNA鎖を用いて、Gd(III)イオン添加によるDNA鎖交換反応が可能であることを示した。来年度は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)等を用いた鎖交換反応の定量評価や速度論解析を行い、鎖交換反応のメカニズムを考察する。
また、より効率的な鎖交換反応の実現や、異なる種類の金属イオンに応答する鎖交換反応の開発を目指し、5-ヒドロキシウラシル(UOH)以外のヤヌス型人工塩基も開発する。DNA鎖中での水素結合型・金属錯体型の両塩基対形成を評価し、両塩基対の相互変換に基づくDNA鎖交換反応を実現する。
さらに、金属配位を駆動力とした鎖交換反応を応用し、金属錯体形成を駆動力とするDNAナノ構造や機能性核酸の構造・機能スイッチングも検討する。
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| Causes of Carryover |
本年度は、当初の予定通り5-ヒドロキシウラシル(UOH)塩基を用いた鎖交換反応の検討を行い、等温条件下での可逆な鎖交換ができることを見出した。DNA配列の検討や反応条件の最適化により鎖交換の効率を向上させることができた一方で、速度論を含む詳細な反応解析は次年度に行うことにした。そのため、蛍光標識DNA鎖など、予定した試薬の一部を次年度に購入することになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、引き続き「ヤヌス型核酸塩基」のヌクレオシド誘導体や人工DNA鎖の合成に必要な有機合成試薬・DNA合成試薬・各種器具を購入する。さらに鎖交換反応の解析に必要な電気泳動実験用の試薬や、蛍光修飾DNA鎖の受託合成、微量測定用の分光セルなどに使用する。さらに、国内学会および国際学会における成果発表のための旅費としても使用する予定である。
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