2016 Fiscal Year Research-status Report
ヘムタンパク質集積体を用いた新規光捕集系の構築と物質変換触媒への応用
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16K14036
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
林 高史 大阪大学, 工学研究科, 教授 (20222226)
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2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 人工光合成 / 光捕集 / ヘムタンパク質 / 補因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内では、多種多様な生体分子が規則的自己集積を経て組織体を形成し、ユニークな機能を発現している例が数多く見られる。たとえば、植物の光合成組織の光捕集系(LH1, LH2)の構造が近年明らかとなり、多くの色素が規則正しくタンパク質中に配置され、高効率で光エネルギーを獲得していることが知られている。本研究では、光合成初期過程の光捕集を行うアンテナ組織(LH1, LH2)を模倣するために、本申請者がこれまでの科学研究費補助金の支援を受けて精力的に実施しているヘムタンパク質人工集積化技術を活かして、色素をタンパク質マトリクス内に環状に配置した人工光捕集デバイスの構築を目的としている。さらに、タンパク質集積体の金属基板への修飾、タンパク質中心空孔への金属錯体導入により、化学エネルギーへの変換と触媒反応への応用を図り、水素発生や水の酸化をつかさどる人工光合成系の創出を最終目標としている。
初年度は、HTHPと呼ばれるヘムタンパク質６量体を用いて、天然のヘムを除去したアポタンパク質に亜鉛ポルフィリンあるいは亜鉛クロリンを挿入した再構成タンパク質を調製し、その光物性を評価することによって、HTHP６量体タンパク質内での、エネルギー移動の挙動を検証した。その結果、予想通り、HTHPのタンパク質内の６つの亜鉛錯体間で光駆動型エネルギー移動が起こっていることを確認した。今後このモデルを用いて、光捕集系を有する効率的な光触媒構築への展開を実施する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、まずHTHP（hexameric tyrosine-coordinated heme protein）の大腸菌による発現と、天然のヘムを除去したアポタンパク質(apo-HTHP)に、亜鉛ポルフィリンまたは亜鉛クロリンを挿入した再構成タンパク質の調製を実施した。全てのヘムポケットに亜鉛錯体が結合したタンパク質について質量分析およびUV測定により同定を行い、光捕集系モデルの６量体タンパク質を収率良く得た。さらに、６つのヘムポケットを有するＨTHPに対して、挿入される亜鉛錯体の分子数の異なる再構成タンパク質を調製し、レーザーフラッシュホトリシス及び蛍光測定から、タンパク質中に含まれる亜鉛錯体の数に依存した分光学的データが得られた。これらの結果から、光照射によって励起した１つの亜鉛錯体から、同じタンパク質内の別の亜鉛錯体にエネルギー移動が起こることを実証した。
次に、天然の光捕集系では、複数の異なる色素によって、可視光を幅広く吸収するシステムを有していることから、今回得られたHTHPの表面にさらに色素を修飾することを試みた。具体的には、HTHPの表面に遺伝子工学的手法を用いてシステイン残基を導入し、マレイミド基を側鎖に有するfluorescein分子を、システイン末端に共有結合によって修飾した。得られたfluorescein修飾再構成HTHPに対して、fluorescein分子を495 nmで励起する光照射を行うと、fluoresceinの521 nmnの特徴的な蛍光の強度は減少し、相対的に亜鉛ポルフィリンの593 nmの蛍光発光が観測された。これにより、fluoresceinから亜鉛ポルフィリンへのエネルギー移動が起きていることが示唆され、本系は、２種類の色素によって、広範囲に光を吸収し、タンパク質内をエネルギー移動するシステムとして機能することが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の展開としては、上記のfluorescein-HTHP(Zn porphyrin) diadに、もう一つの色素（例えば、Texas Red）を再構成HTHPに修飾したtriadを構築し、より広範囲の可視光吸収能力を有する光捕集系モデルの構築を試みる予定である。これによって、可視光のかなりの部分をカバーするアンテナ分子が形成できるものと考えている。この３つの色素間での光駆動型エネルギー移動の効率をモニターし、HTHP表面上での色素修飾の位置の評価・改善も試みる。
次に、HTHP６量体の中心の空孔に、金属触媒を挿入する。例えば、cobaloximeを共有結合でHTHPの空孔に導入し、効率的に捕集した光エネルギーを利用して、金属錯体（触媒）を介した物質変換（水素発生や水の酸化等）を試み、光駆動型の触媒反応への応用に挑戦する。
一方で、さらに弱い太陽光を効率良く利用するために、葉緑体のアンテナを模して、再構成HTHP６量体を１次元（カラム状）あるいは２次元（基板の上に平面状）に集積する手法を確立したい。これによって、色素のクラスター化が達成されるため、光エネルギーを化学エネルギーに変換する総合的な人工酵素モデルが構築できるものと期待している。
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| Causes of Carryover |
計画当初、初年度に実施する予定であった蛍光寿命の測定や、量子収率の測定に必要な検出器の準備や必要とする試薬の調達の遅れと条件検討の難航等で、エネルギー移動の定量的な議論が思うように進まず、次年度に持ち越す実験項目が発生したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記で示したように、蛍光寿命測定に必要なサンプル準備、消耗品の調達、量子収率を算出するための試薬等の経費や、またこれらによって得られる成果の発表のための学会・国際会議出張や論文の添削費用に使用する予定である。
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