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2016 Fiscal Year Research-status Report

動物細胞内での細胞内抗体選択法の開発

Research Project

Project/Area Number 16K14486
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

長棟 輝行  東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (20124373)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2018-03-31
Keywordsバイオテクノロジー / キメラ受容体 / 細胞内抗体スクリーニング / 細胞アレイ
Outline of Annual Research Achievements

細胞内蛋白質を創薬標的として、その機能阻害に抗体を応用する際には、細胞内の還元的環境下で機能を発揮する「細胞内抗体」が必要となるが、既存の方法によって選択された抗体の多くは分子内のS-S結合が還元され細胞内では一般的に不安定であるため、細胞内抗体として機能する抗体をさらに選択する必要が有る。また、細胞内蛋白質は一般的に分離精製過程やプレート表面への固定化過程で変性し易く、抗原となる細胞内蛋白質の正常な立体構造を維持した状態で抗体選択を行うことには困難を伴う。そこで、本研究では次世代抗体医薬品の創製を指向し、細胞内に発現させた蛋白質抗原に対する細胞内抗体を細胞内で迅速に、かつ直接選択可能な汎用的な新規選択法の開発を目的とした。
今年度は、新規抗体選択法の原理実証のために、抗体scFvと受容体c-Mpl細胞内ドメインとを連結した抗体―受容体キメラ、小分子AP20187依存的二量体形成ドメインであるFK506結合蛋白質FKBP12の変異体F36Vと抗原蛋白質を連結した抗原キメラを構築した。AP20187依存的に抗原キメラが細胞内で二量体を形成するかどうかを確認するために、抗原キメラの下流にさらに受容体c-Kit細胞内ドメインを連結した抗原-受容体キメラも構築した。この抗原-受容体キメラ遺伝子を導入したIL-3依存性のプロB細胞株Ba/F3は、AP20187濃度依存的に細胞増殖c-Kit細胞内ドメインの二量体化に基づく細胞増殖シグナルを伝達し、IL-3非存在下でも増殖活性を示したことから、AP20187依存的に抗原キメラが細胞内で二量体を形成することが示唆された。
今後は、抗体scFvと受容体c-Mpl細胞内ドメインとの間のリンカー長を種々に変えた抗体―受容体キメラを構築し、AP20187依存的な細胞の運動性の亢進が見られる抗体―受容体キメラを選択する。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

抗体scFvと受容体c-Mpl細胞内ドメインとを連結した抗体―受容体キメラおよび小分子AP20187依存的二量体形成ドメインであるFK506結合蛋白質FKBP12の変異体F36Vと抗原蛋白質を連結した抗原キメラの遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込み、IL-3依存性Ba/F3細胞株に遺伝子導入を行い、抗生物質選択により安定発現株の取得を行った。この細胞株を光分解性BAM基板上に固定化し、IL-3非存在下、低血清条件下で数時間培養し、その後AP20187を添加して抗原キメラを二量体形成させ、細胞の運動性を評価した。しかし、細胞の運動性の亢進はほとんど見られなかった。抗原キメラの下流に受容体c-Kit細胞内ドメインを連結した抗原-受容体キメラではAP20187依存的に細胞内で二量体を形成することが示唆されたことから、細胞運動性の亢進が見られなかった理由としては、抗体―受容体キメラの抗原依存的な二量体形成が起こっていない可能性が考えられる。今後は、抗体scFvと受容体c-Mpl細胞内ドメインとの間のリンカー長を種々に変えた抗体―受容体キメラを構築し、AP20187依存的な細胞の運動性の亢進が見られる抗体―受容体キメラを選択する。

Strategy for Future Research Activity

AP20187依存的な細胞の運動性の亢進が見られる抗体―受容体キメラを選択した後で、scFv部分にナイーブライブラリーを組み込んだ抗体―受容体キメラライブラリー構築し、これらを安定に発現するBa/F3細胞株を取得する。また、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのサブユニットPB1との結合領域とRNA合成活性領域を含み、安定な3本のαヘリックス構造を有するPB2のN末端領域ドメイン(アミノ酸残基1-259)を抗原とする抗原キメラを用いて、これに特異的に結合するscFvを細胞の運動性の亢進を評価指標にしてscFvのナイーブライブラリーから選択できるかどうかを検証する。

  • Research Products

    (11 results)

All 2017 2016

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results)

  • [Journal Article] A Chemically Inducible Helper Module for Detecting Protein-Protein Interactions with Tunable Sensitivity Based on KIPPIS2017

    • Author(s)
      Daiki Kashima, Raiji Kawade, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara
    • Journal Title

      Analytical Chemistry

      Volume: 89 Pages: 4824-4830

    • DOI

      10.1021/acs.analchem.6b04063

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Engineering a growth sensor to select intracellular antibodies in the cytosol of mammalian cells2017

    • Author(s)
      Thuy Duong Nguyen, Hitoshi Takasuka, Yoshihiro Kaku, Satoshi Inoue, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara
    • Journal Title

      J. Biosci. Bioeng.

      Volume: 印刷中 Pages: 印刷中

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2017.02.017

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Ligand-inducible dimeric antibody for selecting antibodies against a membrane protein based on mammalian cell proliferation.2016

    • Author(s)
      三浦知啓、長棟輝行、河原正浩
    • Journal Title

      Biotechnol. Bioeng.

      Volume: 113 Pages: 1113-1123

    • DOI

      DOI: 10.1002/bit.25858

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Growth signalobody selects functional intrabodies in the mammalian cytoplasm2016

    • Author(s)
      Lee Songhee, Yoshihiro Kaku, Satoshi Inoue, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara
    • Journal Title

      Biotechnol. J.

      Volume: 11 Pages: 565-573

    • DOI

      10.1002/biot.201500364

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Developing a suicide switch for improving quality of scFv libraries2016

    • Author(s)
      Thuy Duong Nguyen, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara
    • Organizer
      Antibody Engineering & Therapeutics 2016
    • Place of Presentation
      Manchester Grand Hyatt San Diego (San Diego, U.S.A.)
    • Year and Date
      2016-12-12 – 2016-12-15
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 細胞内タンパク質間相互作用検出系のホモ二量体化ヘルパーモジュールを利用した高感度化2016

    • Author(s)
      鹿島大揮, 河出来時, 長棟輝行, 河原正浩
    • Organizer
      「細胞を創る」研究会9.0
    • Place of Presentation
      早稲田大学 国際会議場 井深大記念ホール(東京都新宿区)
    • Year and Date
      2016-11-21 – 2016-11-22
  • [Presentation] Highly sensitive detection of intracellular protein‐protein interactions by fusing chemically inducible homo-dimeric module2016

    • Author(s)
      Daiki Kashima, Raiji Kawade, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kwahara
    • Organizer
      The 29th Annual and International Meeting of the Japanese Association for Animal Cell Technology
    • Place of Presentation
      神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
    • Year and Date
      2016-11-09 – 2016-11-12
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Development of an Epitope-selective Antibody Selection System Using a Cell Death Signal2016

    • Author(s)
      Akihiro Eguchi, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara
    • Organizer
      The 29th Annual and International Meeting of the Japanese Association for Animal Cell Technology
    • Place of Presentation
      神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
    • Year and Date
      2016-11-09 – 2016-11-12
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] KIPPIS: Probing intracellular protein-protein interactions with mammalian cell growth2016

    • Author(s)
      Masahiro Kawahara, Satoru Mabe, Teruyuki Nagamune
    • Organizer
      The 22nd symposium of Young Asian Biological Engineers' Community
    • Place of Presentation
      フェニックスシーガイヤリゾート(宮崎県宮崎市)
    • Year and Date
      2016-10-27 – 2016-10-29
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ホモ二量体化モジュールの導入による細胞内タンパク質間相互作用検出の高感度化2016

    • Author(s)
      鹿島大揮, 河出来時, 長棟輝行, 河原正浩
    • Organizer
      第68回日本生物工学会大会
    • Place of Presentation
      富山国際会議場(富山県富山市)
    • Year and Date
      2016-09-28 – 2016-09-30
  • [Presentation] 哺乳類細胞質内を反応場とした細胞内抗体選択プラットホームの開発2016

    • Author(s)
      鹿島大揮, 長棟輝行, 河原正浩
    • Organizer
      2016年度生物工学若手研究者の集い(若手会)夏のセミナー
    • Place of Presentation
      ホテルコンチネンタル府中(東京都府中市)
    • Year and Date
      2016-07-16

URL: 

Published: 2018-01-16  

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