2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of intrabody selection technology in mammalian cells
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16K14486
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
長棟 輝行 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (20124373)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / キメラ受容体 / 細胞内抗体スクリーニング / 細胞内蛋白質間相互作用検出 / 細胞アレイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では次世代抗体医薬の創製を指向し、細胞内に発現させた蛋白質抗原に対する細胞内抗体を細胞内で迅速に、かつ直接選択可能な汎用的な新規選択法の開発を目的とした。
今年度は、ヒト合成ナイーブscFvライブラリーであるTomlinson Iをc-Kitに連結したキメラ受容体ライブラリーならびに狂犬病ウイルスN蛋白質をBa/F3細胞内に発現させ、細胞の増殖ならびにアレイ化した細胞の運動性により評価し、N蛋白質特異的に二量体化しシグナルを伝達するscFv-cKitキメラ受容体のスクリーニングを行った。その結果、scFvとc-Kitの間にGly4Serのペプチドリンカーを挿入したキメラ受容体を用いることによって細胞の増殖を指標に、N蛋白質に特異的に結合するscFv-cKitキメラ受容体の取得に成功した。しかし、運動性の亢進によるスクリーニング方法ではN蛋白質に特異的に結合するscFv-cKitキメラ受容体を選択することは困難であった。
さらに、合成小分子であるAP20187依存的な二量体形成ドメインとして汎用的に利用されているFK506結合蛋白質FKBP12の変異体F36Vとc―Kit細胞内ドメインとの間に抗原蛋白質あるいはscFvライブラリーを挿入した２種類のキメラ受容体を用いて細胞内での抗原とscFv部位の蛋白質間相互作用を検出する系の構築を目指した。モデル系としてP53ペプチドとMDM2のN末端ドメインを挿入した２種類のキメラ受容体を構築し、AP20187濃度を種々に変えた条件下で細胞増殖と運動性を指標として、これら２種類のキメラ受容体の蛋白質間相互作用特異的二量体化を検証した。その結果、F36VとP53ペプチドあるいはMDM2のN末端ドメインの間にGly4Ser を５回繰り返したペプチドリンカーを導入したキメラ受容体が細胞内での蛋白質間相互作用を検出するのに適していることを明らかにした。
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