2017 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質を材料とした革新的繊維素材開発のための技術基盤の構築
| Project/Area Number |
16K14494
|
|---|
| Research Institution | Waseda University |
|---|
Principal Investigator |
赤沼 哲史 早稲田大学, 人間科学学術院, 准教授 (10321720)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 人工繊維 / 金属含有繊維 / タンパク質間相互作用 / アミノ酸置換 / 原子間力顕微鏡 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、人工タンパク質繊維を構築するための技術基盤の確立を目指している。過去の研究では、耐熱性８ヘリックスバンドルタンパク質スレリスリンの両端の表面に疎水性のロイシンを６個ずつ導入し、周りに負電荷アミノ酸を６個配置したスレリスリン改変体と、人工４ヘリックスバンドルタンパク質LARFHタンパク質の両端にロイシンを３個ずつ導入し、その周りに正電荷アミノ酸を３個配したLARFH改変体の混合液を原子間力顕微鏡観察したところ、不均一で、枝分かれが散見されるが、繊維様構造がされた。また、スレリスリン改変体同士の静電的な相互作用が枝分かれの原因はとして推定された。
この結果に基づき、本年度は、前年度に明らかにした、スレリスリン改変体同士の静電的な相互作用に関わる３つリジン残基のうちの２つをグルタミン酸に置換した改変体を作製した。その結果、スレリスリン改変体同士の非特異的な相互作用をほぼ抑制できることを明らかにした。さらに、この改変体を上述のLARFH改変体と混合し、原子間力顕微鏡観察したところ、枝分かれが少ない繊維を観察した。ただし、繊維長は短くなっているようであった。
さらに、LARFHタンパク質の代わりに、リガンドの結合により構造変化する3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（IPMDH）を用いて、動的繊維の開発にも取り組んだ。前年度から引き続き、上述したLARFH改変体と同様に、IPMDH表面のいくつかのαへリックスに疎水性ロイシン残基を導入したIPMDH改変体を多数作製した。それぞれのIPMDH改変体とスレリスリン改変体との相互作用を調べた結果、３種類のIPMDH改変体がスレリスリン改変体と相互作用することを明らかにした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質を材料とした繊維の用途拡大に向けて、本来は繊維化しないタンパク質の表面を改変し繊維化させる技術による新しいタンパク質繊維の開発が求められている。この要望に応えることを目的として、本研究では、スレリスリンとLARFHタンパク質をモデル材料として、自発的に形成される人工タンパク質繊維を構築するための技術基盤の確立を目指している。
これまでに、繊維様構造の構築に成功していたが、不均一で、枝分かれが散見された。この結果に基づき、今年度は、より均一で枝分かれの少ない繊維構造の構築を検討したが、上述の通り、繊維の枝分かれの原因となっていた、スレリスリン改変体同士の非特異的な相互作用に関わる複数のリジン残基を同定し、それらのリジン残基をグルタミン酸に置換することによって、スレリスリン改変体同士の非特異的な相互作用が抑制されることを明らかにした。さらに、リジンをグルタミン酸に置換したスレリスリン改変体とLARFH改変体の混合液の原子間力顕微鏡観察から、繊維長は短くなっていたが、枝分かれが少ない繊維を観察することができた。この結果から、次年度に、スレリスリン改変体とLARFH改変体の結合面の最適化による結合力の強化によって、繊維の長さを伸ばすことができると期待できる。
さらに、前年に引き続いて、リガンドとの結合により構造変化するIPMDHの分子表面にあるαへリックスを遺伝子工学的に改変した多数の改変体を作製し、スレリスリンとの相互作用を調べた。その結果、３つのIPMDH改変体がスレリスリン改変体と相互作用することを観察した。この結果に基づき、結合面の作製に適したIPMDH上のαへリックスを見出すことが出来た。
以上から、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、設計したタンパク質間結合面の最適化に取り組む。スレリスリン改変体とLARFH改変体の結合面を最適化するには、結合面に導入した非極性残基の形状相補性を改善することが効果的であると考え、スレリスリン改変体に導入した６つの疎水性アミノ酸のLeuを１つずつ他の種類の疎水性アミノ酸に置換した変異体を作製し、LARFH改変体に対する結合力を評価する。並行して、LARFH改変体の結合面の最適化にも取り組む。すなわち、LARFH改変体の結合面に導入した３つのLeu残基を、非極性アミノ酸であるLeu、Ile、Met、Phe、Valへとランダムに置換したライブラリーを作製する。次いで、Pull-down法を用いてLARFH改変体のスレリスリン改変体に対する結合の強さを定量的に評価する。スレリスリン改変体と最も強く結合するLARFH改変体結合面の非極性アミノ酸の組み合わせを同定し、そのLARFH改変体とスレリスリン改変体を混合することで、繊維長が長く分岐の少ないタンパク質繊維が構築できるか観察する。
これまでに、LARFH改変体のスレリスリンとの結合面とは別の部位に、金・白金・ニッケルとの結合部位を作製することにも成功している。そこで、LARFHタンパク質に、この金属結合部位とスレリスリンに対する最適な結合面を同時に作製し、スレリスリン改変体と混合することによって、金属含有繊維が構築できるか検討する。
さらに、これまでに、スレリスリンとの結合面の作製に適したIPMDHの表面のαへリックスを同定したので、このαへリックスにLARFH改変体に導入したのと同じ結合面を作製する。スレリスリン改変体と混合することによってIPMDH-スレリスリン繊維の構築が観察されたら、繊維を含む溶液にリガンドを添加することによって線維構造の伸縮が観察できるか検討する。
|
| Causes of Carryover |
研究開始当初に予定していたよりも順調に研究が進捗したため、消耗品の購入額も当初の見込みよりも大幅に少なくなった。また、プル・ダウン法に基づく簡便で効率的なタンパク質分子間相互作用の評価法を開発することができたことも、用品費・消耗品費の支出の抑制につながった。このように、物品費の購入額が当初の見込みよりも少なくなったため、次年度使用額が生じた。次年度は、研究計画の最終年度であるが、次年度使用額を、研究成果を学会や誌上発表のための費用に使うことができる。
|
