2016 Fiscal Year Research-status Report
Multi-layered interface of genes enables regulation of gene transfection timing
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16K14498
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
藤田 聡史 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究グループ長 (00392655)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マイクロ・ナノバイオプロセス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞を積層界面に播種するだけで、複数の遺伝子を様々なタイミングで細胞に取り込ませる事ができる手法の開発を進めた。
H28年度は、遺伝子多重積層界面の構築と安定化および遺伝子導入効率と細胞毒性の評価を行い、多重積層からの遺伝子導入タイミングの評価を主として進めた。カチオン性リポプレックス（プラスミドDNAとカチオン性リポソームの複合体）の混合比と、固相面からの遺伝子導入効率の関係を評価した。カチオン性リポプレックスとヒアルロン酸を交互に積み上げる事で20層の遺伝子多重積層（LbL: Layer-by-Layer）を作製し、その遺伝子導入効率と細胞毒性を評価した。その結果、積層回数が10回程度までは、遺伝子導入効率が向上するが、積層数が増えるほど、細胞接着面が柔らかくなり、細胞の基板面への接着が低下した。それに伴い、遺伝子導入効率も低下する傾向が観察された。
また、本技術を応用し、２種以上の遺伝子の発現を細胞毎で可視化する技術の開発を進めた。モデルとして、２種の遺伝子を個々に封入したリポプレックスを界面に固相化する際にその位置を制御する事で、１細胞毎に細胞に導入した遺伝子の種類を蛍光で検出する新たな手法の可能性を見出した。
現在、遺伝子多重積層面からの遺伝子導入では、２種類の遺伝子の細胞への導入タイミングを24時間以上ずらす事に成功していない。よってH29年度は、遺伝子導入のタイミングをずらすためのLbL材料を複数検討する予定である。遺伝子導入の位置とタイミングを制御する技術を応用した実用化モデルの検討を今後進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遺伝子を基板表面に積層固相化する条件の検討を行った。固相化するカチオン性リポプレックスの量と混合比を変化させ、リポプレックスの表面電位（ゼータ電位）と粒径を測定し、固相化に最適なリポプレックスの作成条件を検討した。ポリスチレン製ディッシュの表面を空気プラズマによりドーピングし、リポプレックスの濃度、DNAとリポソームの混合比を変化させながら、リポプレックスの固相化を行った。その上面に細胞を播種する事で細胞に遺伝子を導入し、細胞毒性と遺伝子導入効率を測定した。カチオン性リポプレックスとヒアルロン酸を交互に積み上げた遺伝子多重積層を作製し、その遺伝子導入効率と細胞毒性を評価した。その結果、積層回数が10回までは、遺伝子導入効率が向上するが、積層数が増えるほど、細胞の基板面への接着が弱くなり、遺伝子導入効率も低下する傾向が観察された。
２種類の異なる蛍光レポータ遺伝子を封入したリポプレックスを作製し、様々な条件でこれを固相化した所、最適条件では70%以上の細胞で、細胞毎で異なる蛍光遺伝子の発現が見られた。この結果は、一細胞毎に異なる遺伝子を固相面から細胞に導入する新たな手法の可能性を示している。
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| Strategy for Future Research Activity |
リポプレックスの多重積層を行う事で、遺伝子導入の時空間制御技術の開発を進める。
現在までの進捗結果を応用し、細胞のバーコード化技術等への応用を考える。プラスミドやsiRNAの断続導入による遺伝子のON/OFFモデルの構築を試みる。
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| Causes of Carryover |
H28年度に実施する予定だった「（Ⅲ）多重積層からの遺伝子導入タイミングの評価」が遅延しているため、本検討に必要な研究費を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
1年目に行う予定だった「（Ⅲ）多重積層からの遺伝子導入タイミングの評価」の項目に記載した内容を本年遂行する。具体的には切れ味よく送達タイミングのON/OFFを制御できるような材料の組合せを検討する。
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