2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K14572
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
内原 俊記 公益財団法人東京都医学総合研究所, 認知症・高次脳機能研究分野, 副参事研究員 (10223570)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 免疫電顕 / Quantum Dot / CLEM / tau / EDX |
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| Outline of Annual Research Achievements |
免疫標識した同一対象の蛍光像と免疫電顕像を直接比較する新技術：Quantum Dot(QD)はセレン(Se)とカドミウム(Cd)からなるnanocrystal で電子密度が高くhaloをもつ粒子として電顕で確認できる一方、蛍光を発するため通常の蛍光顕微鏡でも局在を確認できる。このQD を免疫標識に用いると病変の蛍光像が観察でき、同一標本の同一部位をそのまま電顕標本として再包埋・薄切すれば、同一病変の免疫電顕像としても直接比較できるという画期的な技法を我々は開発した。しかし、これまで免疫電顕に用いられてきた金コロイド標識に比して QDは電子密度が低く、コントラストに乏しい点が弱点であった。 Energy-dispersive X-ray analysis (EDX)は電顕超薄切片に電子ビームをあて、対象元素のエネルギー順位に対応したピークに対応する原子を質的に同定できる。我々は 免疫標識に用いたQDを 標本上でEDX解析し (Am J Pathol 2012; 180:4:1394-7, 2012年日本神経病理学会ポスター賞)、その成分であるSe/Cdを同定する新たな方法を発展させ、その分布を画像化する EDX mappingを世界に先駆けて完成させた (Acta Neuropathol Comm 2014;2:161- 2014年日本神経病理学会ポスター賞)。 Gray scaleと相場が決まっている免疫電顕像から標識QDのみを highlightできるこの手法は、蛍光像と対比することで、光顕レベルから分子レベルまで seamlessに連続した scaleで対象を観察できる画期的な手法となる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
従来免疫電顕に用いられたcolloidal goldによる標識は、組織への浸透性が乏しく、エポン切片作成後、 postembeddingにより標識するのが標準的な方法であった。モデル動物や細胞の様に一様の対象が大量に存在する場合は応用可能だが、ヒト神経疾患のように、多様な病変が疎に散在する場合は観察対象の適切な部位の免疫電顕像が得られる確立は低い。そこで本年度はより浸透性の高い nanogold粒子に注目して研究をすすめた。蛍光色素に結合した nanogold (fluoronanogold:FNG)を免疫標識に用いれば、その蛍光像を手がかりに光学顕微鏡像を得ることができ、その位置情報をたよりに同一細胞を同定し、電顕用にトリミングすることも可能と期待された。実際、FNGで標識したヒト脳切片で蛍光像をとらえることができた。さらにFNG標識した切片全体を塩化金液で処理してnanogold粒子の視認性を高めた結果、光学顕微鏡でその輪郭を捉えることができた。エポン包埋後も実体顕微鏡でその輪郭を捉えることが可能で、超薄切片作成段階でのトリミングが容易となった。このFNG標識+塩化金増感法はQDに比して遙かに視認性が高く、標識としての信頼性を高めることに成功し、スイス ローザンヌで開催された学会 (Microscopy 2017)や京都で開催された国際学会(World Congress of Neurology 2017)で発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度開発したFNG+塩化金増感法により免疫標識はQDより視認性が高いだけでなく、QD標識と容易に区別できる。そこで今後はFNGや QDを組み合わせて、二つのエピトープを光顕（蛍光）と免疫電顕の両方で直接比較する方法を実現する。ヒト脳に散在する病変を免疫電顕で観察するためには、光学顕微鏡による対象病変の同定が肝要である。本年度はアルツハイマー病脳幹にさまざまな密度で散在する神経原線維変化の分布を定量的にとらえる為に、多重蛍光免疫染色した標本に含まれる全ての病変を、 virtual slideを用いて網羅的にデジタル化する新たなアプローチ(CENSUS: Complete Enumeration and Sorting for Unlimited Sectors)を別の研究で確立した。この方法を用いれば観察対象が標本上のどこにあっても、漏れなく光学（蛍光）像としてとらえることが可能で、その中から最適と思われる病変を選択して、免疫電顕標本に移して、直接比較することができる。FNG+塩化金増感とCENSUS法を組み合わせることで二重免疫標識を光顕と電顕で直接比較できる画期的な方法が実現できる見通しが具体化しつつある。
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| Causes of Carryover |
二重免疫染色を光顕と電顕で直接比較する本研究では、標本の作製に洗練された技術と膨大な手間がかかる。本年度はこれまで購入した試薬と用意した標本を用いて、適正な標本の作製を行った為、大幅に費用を節約することが出来た。来年度に入り次第、これを大型の電子顕微鏡で解析する予定をたてている為、それに関わる経費に充て、学会での結果発表やその後の論文作成の為の英文校正や論文の投稿、別刷り等の費用に充てる。
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