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2018 Fiscal Year Research-status Report

二重標識光顕・電顕法の開発と神経変性病変への応用

Research Project

Project/Area Number 16K14572
Research InstitutionTokyo Medical and Dental University

Principal Investigator

内原 俊記  東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 特任教授 (10223570)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2020-03-31
KeywordsCLEM / Quantum dot / gold enhance / double labeling
Outline of Annual Research Achievements

免疫標識した同一対象の蛍光像と免疫電顕像を直接比較する新技術:Quantum Dot(QD)はセレン(Se)とカドミウム(Cd)からなるnanocrystal で電子密度が高くhaloをもつ粒子として電顕で確認できる一方、蛍光を発するため通常の蛍光顕微鏡でも局在を確認できる。このQD を免疫標識に用いると病変の蛍光像が観察でき、同一標本の同一部位をそのまま電顕標本として再包埋・薄切すれば、同一病変の免疫電顕像としても直接比較できるという画期的な技法を我々は開発した。しかし、これまで免疫電顕に用いられてきた金コロイド標識に比して QDは電子密度が低く、コントラストに乏しい点が弱点であった。 Energy-dispersive Xray analysis (EDX)は電顕超薄切片に電子ビームをあて、対象元素のエネルギー順位に対応したピークに対応する原子を質的に同定できる。我々は 免疫標識に用いたQDを 標本上でEDX解析し (Am J Pathol 2012; 180:4:1394-7, 2012年日本神経病理学会ポスター賞)、その成分であるSe/Cdを同定する新たな方法を発展させ、その分布を画像化する EDX mappingを世界に先駆けて完成させた (Acta Neuropathol Comm 2014;2:161- 2014年日本神経病理学会ポスター賞)。 Grayscaleと相場が決まっている免疫電顕像から標識QDのみを highlightできるこの手法は、蛍光像と対比することで、光顕レベルから分子レベルまで seamlessに連続した scaleで対象を観察できる画期的な手法となる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト脳ホルマリン固定標本から作製した浮遊切片fluoronanogold粒子で標識し、その蛍光像でとらえた対象をトリミングして、免疫電顕としてもとらえなおして比較する新たな方法を昨年度開発した。本年度は
①マウス脳の血管内皮に発現し、血液脳関門の機能に関連するglucose transporter 1に注目した。glut 1は生理的な機能タンパクで正常構造中に局在する分子で、光顕で同定した血管の三次元構造のどの深さにglut1が位置するかを正確に同定するには光顕と電顕双方の三次元的な比較が必要となる。透過電顕像は切片のXYの解像度は高いが、Z軸方向の解像度についての情報は得られない。今回免疫電顕の連続切片像と同一部位免疫蛍光三次元像を比較し、その内皮細胞内の局在を明確に示すことができた。
②Quantum dotはその大きさと形に依存する波長の蛍光を発するnanocrystalで、免疫標識として用いればその蛍光像と免疫電顕像を直接比較できる。異なる種類のQDで異なる抗原を免疫標識できれば二重染色が理論的に成立するが、QDの電子密度は両者の大きさや形を区別できる程には高くない。本年度は免疫標識したQDを電顕切片上で塩化金で増感した。増感により沈着した金は一様に沈着するのではなく、元のQDの形に依存して偏った金結晶を形成することを見出した。これを用いて、視認性の高い免疫電顕二重染色が、光顕と直接比較できる形で実現できた。以上の成果の一部を2019年3月にリスボンで開催されたパーキンソン病・アルツハイマー病国際会議で発表した。

Strategy for Future Research Activity

QDの塩化金による増感は元のQDの形に依存して異なるパタンを呈するという2018年度の成果を踏まえ、異なる種類のQDやfluoronanogoldを組み合わせ、光顕・電顕像の直接比較が可能な多重染色法を完成する。当初の目的であるアルツハイマー病の神経原線維変化の3リピート(3R)タウ、4リピート(4R)タウの2重染色による両者の関係、glut1に関連する分子とglut1の関係などが当面の対象となるが、応用範囲は広くあらゆる領域で利用可能な新技術となることが期待される。
進行性核上性麻痺のタウは4Rのみ、アルツハイマー病のタウは3Rおよび4Rの2種類からなることが知られている。アルツハイマー病の4Rタウは279番目のアスパラギンが脱アミド化されアスパラギン酸に翻訳後不可逆的に修飾をうけることが知られている。この修飾をうけた4Rタウを特異的に検出する抗体分画を得ることに我々は世界で初めて成功し、最近論文発表した。アルツハイマー病脳では経時的にこの脱アミド化がおこると考えられ、それにつれてタウの局在や超微形態がどのように変化するかは神経原線維変化の形成過程の本質に迫る可能性がある。より力価の強い抗体を確保して、本課題で開発中の多重免疫光顕・電顕法に応用する予定である。

Causes of Carryover

ヒト剖検脳を用いた多重染色による光顕と電顕の比較についての当初の課題に関するデータ取得がほぼ当該年度中に終了した。この新たな技術をさらに発展させる新規の課題として①動物標本を用いて、3次元で光顕と電顕の比較を行う。②ADとPSPで異なるタウの特徴を同定する。③様々なタウ病変を比較して診断に反映させる国際共同研究などが既に始動している。これらを学会、論文として発表する為に次年度使用が不可欠となった。

  • Research Products

    (10 results)

All 2019 2018

All Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 3 results) Presentation (3 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results)

  • [Journal Article] Detection of AD-specific four repeat tau with deamidated asparagine residue 279-specific fraction purified from 4R tau polyclonal antibody2019

    • Author(s)
      M. Ebashi S. Toru A. Nakamura S. Kamei T. Yokota K. Hirokawa and T. Uchihara
    • Journal Title

      Acta Neuropathol

      Volume: 138 Pages: 163-166

    • DOI

      10.1007/s00401-019-02012-0

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Parkinson's disease: Is it a consequence of human brain evolution?2019

    • Author(s)
      N. J. Diederich D. James Surmeier T. Uchihara S. Grillner and C. G. Goetz
    • Journal Title

      Mov Disord

      Volume: 34 Pages: 453-459

    • DOI

      10.1002/mds.27628

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] How to demix Alzheimer-type and PSP-type tau lesions out of their mixture -hybrid approach to dissect comorbidity-2019

    • Author(s)
      Momoko Ebashi, Yoshinori Ito, Miho Uematsu, Ayako Nakamura, Katsuiku Hirokawa, Satoshi Kamei and Toshiki Uchihara
    • Journal Title

      Acta Neuropathologica Communications

      Volume: 7 Pages: 71

    • DOI

      https://doi.org/10.1186/s40478-019-0708-4

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Does This Adult Patient With Jolt Accentuation of Headache Have Acute Meningitis?2018

    • Author(s)
      Tamune Hidetaka、Kuki Takaie、Kashiyama Tetsuya、Uchihara Toshiki
    • Journal Title

      Headache: The Journal of Head and Face Pain

      Volume: 58 Pages: 1503~1510

    • DOI

      doi: 10.1111/head.13376

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Neurological CPC MIBG心筋シンチグラフィー集積低下を示し,臨床的には進行性核上性麻痺が疑われた64歳女性例2018

    • Author(s)
      吉村 菜穂子、福田 隆浩、藤ヶ﨑 純子、星野 晴彦、本間 琢、内原 俊記、田久保 秀樹、河村 満、井口 保之、織茂 智之、後藤 淳、鈴木 正彦
    • Journal Title

      BRAIN and NERVE

      Volume: 70 Pages: 929~936

    • DOI

      doi: 10.11477/mf.1416201101

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Time-dependent and lesion-dependent HMGB1-selective localization in brains of patients with cerebrovascular diseases2018

    • Author(s)
      Umahara T, Uchihara T, Hirokawa K, Hirao K, Shimizu S, Hashimoto T, Terasi H, Hanyu H.
    • Journal Title

      Histol Histopathol

      Volume: 33 Pages: 215-222

    • DOI

      :10.14670/HH-11-914

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 風邪のなかにひそむ髄膜炎を見抜くためにー髄膜刺激徴候とjolt accentuationの限界と応用2018

    • Author(s)
      内原 俊記
    • Journal Title

      内科

      Volume: 122 Pages: 1173-1176

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Quantum dot immunolabeling for exact correlative light and electron microscopy: ultrastructural visualization of the targets selected by fluorescent microscopy2019

    • Author(s)
      Uchihara,M. Uematsu, S. Tatsumi, R. Takahashi, M. Yoshida
    • Organizer
      The 14th International Conference on Alzheimer's and Parkinson's diseases
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Possible distinction of 4R tau-positive lesions of AD and PSP probed by 4R-specific antibodies2019

    • Author(s)
      Uchihara T, Ebashi M, Uematsu M, Nakamura A, Ito Y, Hirokawa K, Kamei S
    • Organizer
      The 14th International Conference on Alzheimer's and Parkinson's diseases
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 部分をみながら半球標本全体も俯瞰する デジタル画像新技術extended CENSUS2018

    • Author(s)
      内原 俊記1,2,3), 融 衆太, 本間 琢, 宍戸-原由紀子, 植松 未帆, 廣川 勝昱
    • Organizer
      第37回日本認知症学会

URL: 

Published: 2019-12-27  

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