2016 Fiscal Year Research-status Report
自閉症関連シナプス接着因子の細胞内シグナル誘導機構解明のための研究手法の確立
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16K14592
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
田渕 克彦 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20546767)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / βアクチン / シナプス / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集による、単一ニューロンで遺伝子変異をノックインする手法を開発するために、βアクチン遺伝子の翻訳開始部にEGFPをコードする遺伝子を子宮内エレクトロポレーション法により挿入することを試みた。βアクチン遺伝子の翻訳開始部位を標的としたsingle-guide RNA（sgRNA）をデザインし、Cas9発現カセットとこのsgRNA発現カセットが共存するベクターを作成した。このベクターと、EGFPコード遺伝子の両端に、βアクチン遺伝子の翻訳開始コドンの5’側と3’側の約500 bpをそれぞれホモロジーアームとして付加したベクター（ドナーベクター）を、TagRFPマーカーコンストラクトと共に子宮内エレクトロポレーション法により胎生15日目のマウスの脳室周辺神経芽細胞に導入した。この時期のエレクトロポレーションでは、遺伝子導入細胞は成熟後に大脳皮質2/3層の錐体ニューロンになる。遺伝子導入マウスが成熟後、脳切片を作成したところ、RFP陽性の遺伝子導入ニューロンの約1.7%で、EGFPのシグナルが検出された。パッチピペットでEGFP陽性ニューロンからRNAを抽出し、RT-PCRを行い、これらのニューロンでEGFPがβアクチン遺伝子の翻訳開始部に正しくノックインされていることが確認された。EGFPのシグナルは、樹状棘突起で強い発現を示しており、βアクチンの局在パターンと一致していた。子宮内エレクトロポレーション法により、EGFP-βアクチンコンストラクトを過剰発現したものでは、樹状棘突起の数の増加が引き起こされたが、EGFPのノックインのものでは、樹状棘突起の数の増加は見られず、電気生理学的解析において、ニューロンの発火パターンやシナプスの自発的放出頻度にも野生型ニューロンと比較して変化が見られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
子宮内エレクトロポレーション法とCCRISPR/Cas9システムとを組み合わせた方法により、マウスの脳内の単一ニューロンにおいてノックインを行う技術を開発することに成功したため、技術開発という点では当初の目的がある程度達成できたと言える。我々が中心に行う解析手法は、パッチクランプ法を用いた電気生理学であるため、より高効率にノックインする必要がある。また、βアクチン遺伝子にとどまらず、シナプス機能、特に自閉症の原因と関係しているシナプス分子について応用できるようにしたいと考えており、これについて今後詰めていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回成功したノックインニューロンの割合は、子宮内エレクトロポレーション法で遺伝子を導入したニューロンの約1.7%であった。また、殆どのものは、単一アリルのみでのノックインにとどまっていた。今後、さらなる条件検討を行い、ノックイン効率の向上を目指す。このために、エレクトロポレーションを行う時期や、エレクトロポレーションにて与える電気パルスのプロトコールをいろいろ試す。プラスミドDNAの溶液の組成も改変してみる。また、Cas9タンパク質を直接エレクトロポレーションで導入することも検討する。そして、βアクチン遺伝子にとどまらず、他の分子についても変異の導入を試みる。
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| Causes of Carryover |
当初より2年間の研究として計画しており、2年目である平成29年度は、より高効率に単一ニューロンで遺伝子のゲノム編集が行えるよう、様々な条件検討を行う。このため、精力的に子宮内エレクトロポレーションを行うため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は平成29年度請求額と合わせて、CRISPR/Cas9コンストラクトやドナーコンストラクトなど、子宮内エレクトロポレーション法で導入するDNAを作成するための分子生物学実験試薬やチューブなどプラスチック器具、電気生理学的、形態学的実験試薬、マウス購入、飼育費用に使用する。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Fluorescent protein tagging of endogenous protein in brain neurons using CRISPR/Cas9-mediated knock-in and in utero electroporation techniques.2016
Author(s)
Uemura T, Mori T, Kurihara T, Kawase S, Koike R, Satoga M, Cao X, Li X, Yanagawa T, Sakurai T, Shindo T, Tabuchi K.
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Journal Title
Sci Rep.
Volume: 6
Pages: 35861
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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