2017 Fiscal Year Research-status Report
自閉症関連シナプス接着因子の細胞内シグナル誘導機構解明のための研究手法の確立
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16K14592
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
田渕 克彦 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20546767)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9 / 子宮内エレクトロポレーション / beta-アクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度で、CRISPR/Cas9システムと子宮内エレクトロポレーション法を組み合わせて、大脳皮質単一ニューロン特異的に、βアクチン遺伝子にEGFPをノックインする方法の開発に成功したが、ノックイン効率は、RFPで標識される全遺伝子導入ニューロンのうち、数%程度だった。本研究は、シナプス接着因子をはじめとする自閉症関連遺伝子に、ヒト患者から発見された変異を導入し、パッチクランプ法などを用いて、単一ニューロンレベルで、遺伝子変異の効果を解析する技術の開発を目指している。ヒト疾患変異のみをクリーンな形で導入する場合、EGFPなどにより、ノックインの成功の有無を見分けることができないため、ノックインの成功の有無は、パッチクランプ法により電気的活動を記録した後、パッチピペットからmRNAを吸引してgenotypingをし、確定することになる。このため、ノックイン効率が数%程度では、解析したもののうち大部分がノックインされていないことになり、実際の実験に用いるには非現実的である。このため、当年度では、ノックイン効率を高めるための技術開発に重点的に取り組んだ。昨年度は、EGFPをβアクチン遺伝子の翻訳開始点直後にノックインするためのドナーベクターとして、相同領域を両側とも0.5kbで行っていたが、相同領域の長さを延長し、1.6kbと2kbにしたところ、遺伝子導入ニューロンにおけるノックインされたニューロンの割合は、10%以上に上昇した。この条件で、相同組み換え効率を上げることが知られている、Rad51タンパク質をコードする遺伝子コンストラクトを同時に導入したところ、ノックイン効率は20%を超えた。これらは、胎生15日目にエレクトロポレーション法をしたものだが、これをさらに幼弱な時期として、胎生13日目にエレクトロポレーションを行ったところ、ノックイン効率が48%まで上昇した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術は、幅広い分野で活用されるようになってきており、様々な分野の研究者にとって、興味の対象となっている。この中で、遺伝子改変動物の交配を行わず、単一世代で、特定の細胞において遺伝子改変を行う技術は魅力的である。特に、脳のニューロンのような、非分裂細胞に特異的に遺伝子を導入し、遺伝子ノックインをするという研究は、世界でもわずかであり、我々のグループはパイオニアの一つである。この技術はいくつものハードルがあり、最も克服すべき共通の問題は、ノックイン効率が低いことである。平成29年度の研究で、我々は、遺伝子導入ニューロンのうち最大で約50％に達するノックイン導入効率を得ることができた。これは、これまで数％だったことに比べれば、飛躍的な進展である。これは、他の様々な遺伝子でも応用可能であり、当該分野の他の研究者への波及効果も高いと考えらる。一方、平成29年度で、βアクチン遺伝子以外の遺伝子についてもノックインを行い、機能解析をしようと計画していたが、そちらについてはあまり取り組まず、もっぱらノックイン効率を高める研究に重きを置いた。以上を総合して、平成29年度の研究はおおむね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度に重点的に取り組んだ、子宮内エレクトロポレーションによる、マウス大脳皮質2/3層の錐体ニューロンでのβアクチン遺伝子へのEGFPのノックイン効率を高めた技術開発について、論文を作成する。必要なデータはおおむね出そろっているが、統計処理など、再現性を加味して慎重に行うために、子宮内エレクトロポレーションを繰り返し行いN数を重ね、完成度の高いデータを作成する。また、βアクチン以外の遺伝子についても、ノックインを試みる。
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| Causes of Carryover |
本研究開始後、比較的早期に子宮内エレクトロポレーション法とCRISPR/Cas9システムを組み合わせた、マウスの脳での遺伝子ノックインが成功し、これについては論文に発表することができた。一方、ノックイン効率が低いことが、今後、この技術を実用化していく上で最大の問題となるため、研究の中心を、ノックイン効率の向上にシフトした。平成29年度は、ノックイン効率を上げるための試行錯誤に専念したため、ここで確定した条件を、さらに解析のN数を増やして勢力的に仕上げの実験を平成30年度に行うことにしたため、平成30年度使用額が生じた。平成30年度は、マウスの飼育・維持費、導入遺伝子を生成するための分子生物学実験消耗品、形態学的解析消耗品、および印刷費に予算を使用する。
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