2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a technique to study signaling mechanism of synaptic adhesion molecules relevant to autism.
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16K14592
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
田渕 克彦 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20546767)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9 / Rad51 / b-actin / 子宮内エレクトロポレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに見出した、CRISPR/Cas9システムと子宮内エレクトロポレーション法を組み合わせたマウス大脳皮質ニューロン特異的な遺伝子のノックインの効率を高める方法として、ターゲットとするb-actin遺伝子のN末コード領域へEGFPを導入するためのドナーベクターの相同アームの長さを最大限に延長することと、DNA修復タンパク質Rad51の発現コンストラクトとの共導入の効果について、論文作成に向けて、データ取得のN数を増やし、実験の精度を高めるとともに、統計データを作成した。guide-RNAの標的サイトであるb-actinの翻訳開始点から3’方向へ1,952 bp、5’方向へ1,576bpさかのぼったDNAフラグメントはb-actinのすべてのコード領域を含み、プロモーター領域の一部も含むと考えられるが、ドナーベクター単独ではEGFPを発現しないことを確認した。このドナーベクターを用いて胎生15日目のICRマウスの脳室周辺神経芽細胞に子宮内エレクトロポレーションを行うと、遺伝子導入ニューロンのうちの15%でEGFPのノックインが確認された。一方、5’および3’それぞれ500 bpの相同アームを有するドナーベクターを用いた場合の導入効率は2.4％にとどまった。また、このドナーベクターに加えてRad51発現ベクターを共導入すると、ノックイン効率が25%まで上昇した。Rad51の過剰発現によって、シナプスの数や形態に異常をきたさないことも確認した。また、Cas9によって標的遺伝子が切断された後の非相同末端結合（NHEJ）を阻害する薬剤であるSCR7をDNAに添加しても、ノックイン効率は変化しなかった。これらのことから、Rad51の共導入が、ノックイン効率を上昇するために非常に強力なツールになるという結論を得た。
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