デグロンシステムを利用した全能性幹細胞樹立の試み

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14594
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 杉原 一司 京都大学, 医学研究科, 技術職員 (10377418)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 成瀬 智恵 京都大学, 医学研究科, 助教 (30372486) ; 浅野 雅秀 京都大学, 医学研究科, 教授 (50251450)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: マウス初期胚発生 / デグロンシステム

Outline of Annual Research Achievements

（１）マウス初期胚において、外来遺伝子の発現が制御可能なデグロンシステムをマウス受精卵に導入する条件の検討を行なった。マウス初期胚に一過性にデグロンシステムベクターを導入したところ，AIDシステムを用いた場合には、細胞毒性が強く胚が死んでしまいうまくいかなかった。そこで、新たに検討を行ったARDデグロンシステムを使用した場合には20 μg/mlの濃度でインジェクションを行っても細胞が死滅することはなかった。ただし，発生率が悪かったので至適濃度を探索するために、さらに低濃度でのインジェクションを行うこととした。また，初期胚の内在性ゲノムに発現マーカーを効率的に導入するためのベクターを構築した。ES細胞やマウス胎仔繊維芽細胞，骨髄細胞などへの導入が可能であったことから，様々な細胞に簡便に発現マーカーを導入する系の立ち上げに成功した。この方法で受精卵に導入することで、８細胞期胚に強発現している遺伝子をモニターすることにより、８細胞期とそれ以外の細胞の区別がつけられると考えられた。
（２）昨年度までに公的データベースより見出した， 8細胞期前後に発現量が大きく変化すると考えられる遺伝子の，マウス初期胚における発現変化を定量的RT-PCRを用いて解析した。発現量補正遺伝子についても検討し，リボソーム関連遺伝子で補正をすることにした。C57BL/6Jの初期胚を用いて，候補遺伝子の発現量変化を解析した結果，現在のところ５遺伝子が８細胞期から桑実胚期にかけて強く発現することがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

デグロンシステムが各種細胞で機能することを確認し，簡便にノックインを行うことができる系を立ち上げた。

Strategy for Future Research Activity

受精卵及びES細胞を用いて，８細胞期から桑実胚期にかけて強く発現することがわかった遺伝子にマーカー遺伝子をノックインして，８細胞期の状態を保持する培養条件および遺伝子発現などを調べる予定である。

Causes of Carryover

主にデグロンベクターのマウス初期胚での細胞毒性の検討に時間が取られたことが原因である。
さまざまな遺伝子についてのベクターをマウス初期胚に導入する実験をこのあと実施予定であり、マウス初期胚を得るためにマウスを必要数購入する費用や、発生した胚を移植する偽妊娠メスを購入する費用、飼料などの飼育経費などが必要となる。本年度はこれらの費用に使用される予定である。