2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of intracellular binary counter for recording the gene expression change
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16K14603
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
小野寺 康仁 北海道大学, 医学研究院, 講師 (90435561)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現解析 / 遺伝子構築 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初設計した遺伝子構築を完了し、実際に動作させた場合の挙動を検討するため、細胞内への安定導入を試みた。その際、遺伝子構築が複数個入ってしまうことを避けるため、ウイルスやトランスポゾン等ではなく、ゲノム編集による特定部位への導入を行うこととした。ヒトゲノム中のsafe harbor領域をいくつか選定し、各相同遺伝子座に異なる構築を１つずつ挿入することを試みた。狙い通りの編集が起こった細胞のみを選択するためには各遺伝子構築に別々の選択マーカーを導入する必要があるが、導入する遺伝子構築では蛍光タンパク質を多数使用するため、薬剤耐性マーカーを用いた。しかしながら、既知の薬剤耐性遺伝子のほとんどは偽陽性細胞を多数生じてしまい、目的通りのゲノム編集が起こった細胞を得るためには、単一細胞のクローニングが必要であった。がん細胞の遺伝子発現（およびその変動）の不均一性の解析が本研究の目的の一端であるが、クローニングの作業はその不均一性を失わせる原因となり得るものであり、結果に大きなバイアスが生じる可能性が懸念された。
そこで、本研究に必須のツールとして、偽陽性率が非常に低いピューロマイシンとその耐性遺伝子を用いた選択を複数の遺伝子構築に対して行うことができる「分割型ピューロマイシン耐性遺伝子」を作製した。２～４分割することに成功し、これら全てが存在する場合のみ、細胞が薬剤耐性を得ることを確認した。２分割した耐性遺伝子を、異なる蛍光タンパク質を発現する遺伝子構築に組み込み、安定導入後ピューロマイシンで選択したところ、選択された細胞においては９９％以上の効率で両方の蛍光タンパク質が発現していた。本ツールは本研究の過程で得られた副産物的なものではあるが、細胞生物学一般において非常に有用なものであるため、別途、論文発表を行う予定である。上記の過程で得られたベクターを用いた研究は、幾つか発表済みである。
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