切断-融合-架橋サイクルによるゲノム構造変異を人工的に導入するマウス実験系の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14609
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 國府 力 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (70379238)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ゲノム / 癌 / ゲノム工学 / マウスES細胞

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度には、まず、第一世代の架橋選択ベクターが染色体上のある遺伝子座Aに挿入された培養マウスES細胞株A<bfb＞に対して、切断―融合ー架橋変異（Breakage-Fusion Bridge, BFB）の人為的誘導を試み、BFB変異の形成が期待されるES細胞クローンを薬剤選択によって約100クローン単離した。
次に、これらのES細胞クローンに対して、ベクター部分にBFB接合部が形成されたかどうかをPCRによってDNAレベルで鋭敏に検出する系を確立した。また、BFB接合部におけるマーカー遺伝子の発現様式を、RACE法などを用いてRNAレベルでも詳細に解析した。さらに、接合部のPCR陽性および陰性のES細胞株の中から適切なクローンを選び、対照としてのランダム構造変異導入ES細胞株ならびに野生型ES細胞株とともに、次世代シークエンサーによる全ゲノムシークエンス解析を実施した。その結果、本ベクターが挿入された染色体上においては、染色体特異的にBFB型の構造変異が形成されていることを確認することができた。なお、今年度の全ゲノムシークエンス解析は、本研究課題に基づいて応募した新学術領域「先進ゲノム支援」による支援を受け、これまでに連携研究者とともに開発してきたゲノム構造変異解析ソフトウェアCOSMOS (Yamagata K. et al, Nucleic Acid Research 2016)を用いて実施したものである。
以上の検討の結果、第一世代のベクターを一部改良してマーカー遺伝子の発現効率を改善した汎用型架橋選択ベクターを開発すれば、ゲノムワイドにBFB導入可能部位の網羅的スクリーニングを実施することが可能になると考えられた。そこで、我々は、この第二世代ベクターの設計と製作をほぼ年度内に完了した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度は、架橋選択ベクターが挿入された培養マウスES細胞株においてBFB型の構造変異が誘導可能であることをDNAレベルおよびRNAレベルで確認・検証し、さらに改良型のベクターの設計・作製をおこなった。当初計画にあった比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）による解析は、年度内に実施することができなかった。しかし、平成29年度に予定していた次世代シークエンサーによる全ゲノムシークエンス解析は、新学術領域「ゲノム支援」の支援を受けた結果、一部前倒しで実施することができた。したがって、全体としては、ほぼ計画通りの進捗状況と判断している。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度末に完成した第二世代ベクターを用いて、培養マウスES細胞に対するゲノムワイドなBFB型構造変異の導入を行い、BFB変異を起こしても細胞死を回避できる染色体部位をゲノムワイドにスクリーニングする。この実験によって、BFB変異を発生し得るゲノム領域の特徴を明らかにするとともに、BFB導入後の染色体の回復過程を解析し、BFBの意義とサイクル化の条件を探る。本研究の結果をまとめ、学会発表ならびに論文投稿を行う。