Screening of no-coding RNA that can control transcription and chromatin

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K14638
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 村上 洋太 北海道大学, 理学研究院, 教授 (20260622)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: non-coding RNA / 転写制御 / スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

真核細胞で広くみられるnon-coding RNAの機能の多くは未知である。一部のnon-coding RNAは転写制御に関与する事が示されている。本研究では転写制御に関与するnon-coding RNAのスクリーニング系を構築し、網羅的スクリーニングを転写、クロマチン制御の良いモデル生物である分裂酵母を用いておこなうことを目的とした。平成28年度の解析から当初予定したシステムがスクリーニングに適さないことが判明したため、平成29年度はＤＮＡ結合ドメインとして、CRISPER-dCAS９により、RNAをレポーター上流に導入する系の構築に集中した。この系ではCRISPERのgRNA末端にスクリーニングするRNAを結合させ、ゲノムの任意の場所にそのRNAをリクルートすることができる。モデル生物としてよく使われる出芽酵母を使い、dCAS9を任意の場所に効率良くリクルートできることを確認した。次に分裂酵母において同様の系を構築し、標的領域へのdCAS9のリクルートは確認できたが、その効率は出芽酵母の1/10程度であった条件設定により、最終的に出芽酵母の1/3程度の効率まで引き上げることができた。
次にgRNA の3’末端に転写活性化能をもつタンパク質と結合しうるRNAを結合することにより、dCas9を介して転写活性化タンパク質がレポーター遺伝子上流にリクルートされ転写が活性化されるかを検討した。このシステムでMS2が微量ながらレポーター上にリクルートされていたが、しかし、レポーターの活性化は観察できなかった。これは、もともとのdCas9のターゲッティング効率が低く、転写活性化にいたるに十分なMS2をリクルートできていないためと考えている。そこで、分裂酵母でのgRNAの発現系がribozymeを使用するなどトリッキーなところに問題があると考え、現在この発現系の改良に取り組んでいる。