半合理的なゲノム進化デザインを可能とする自己進化型ゲノム編集システムの創成

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14654
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 西田 敬二 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (10620338)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: Target-AID / Target-G / CRISPR / Cas9 / ゲノム編集 / 人工進化

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的はゲノム中の特定の領域の進化速度を高速化する分子システム、およびそのシステムが自身を標的とすることによって自己進化するようなシステムを構築し、その分子進化過程の系統解析を行うことによって、機能強化に至る変異の同定を行い、強力な自己進化人工酵素を獲得することである。
本年度はDNA脱塩基反応を行うglycosylaseにDNA配列認識能としてCRISPR-Cas9のヌクレアーゼ活性を失活させたdCas9を結合することにより、任意の特定配列の近傍に点変異を導入する人工酵素を作成し、実際に酵母細胞内にて発現させて、標的遺伝子への変異導入効率を検証した。薬剤によるカウンターセレクション可能なCan1遺伝子変異を指標に、数％程度の変異導入が可能な条件を見出すことが出来た。そしてこの人工酵素が自らのコード遺伝子を標的とすることで、細胞内において自己進化を行うようなベクターを設計して構築を進めている。同時に次世代シーケンサーによる配列解析と変異系統解析を行うことができるパラメーターの検討と計算プラットフォームを構築した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

人工進化酵素の基となるDNAグリコシラーゼ活性についてモデルケースでの検証を行うことが出来、実際の人工進化ベクターの設計を完了することができた。また解析プラットフォームを整備してパラメータの検証も進めることが出来た。

Strategy for Future Research Activity

実際に設計された人工進化ベクターを細胞内で動作させ、NGS解析プラットフォームによって解析試験を行い、想定するようなデータ取得および解析作業が行えるかどうかを検証し、必要に応じて改変を行う。さらに得られる人工進化酵素についてその酵素活性の変化を検証する。

Research Products

• [Journal Article] Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. (2017)
  • Author(s): Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, Terada R, Arazoe T, Ishii H, Teramura H, Yamamoto T, Komatsu H, Miura K, Ezura H, Nishida K, Ariizumi T, Kondo A.
  • Journal Title: Nat Biotechnol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1038/nbt.3833
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. (2016)
  • Author(s): Nishida K, Arazoe T, Yachie N, Banno S, Kakimoto M, Tabata M, Mochizuki M, Miyabe A, Araki M, Hara KY, Shimatani Z, Kondo A.
  • Journal Title: Science Volume: 353(6305) Pages: aaf8729
  • DOI: 10.1126/science.aaf8729
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant