Development of a new transformation method of Bacillus subtilis with chemically modified DNA

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K14657
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 柘植 謙爾 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命准教授 (70399690)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ゲノムデザイン学 / 形質転換 / 化学修飾DNA

Outline of Annual Research Achievements

枯草菌の長鎖DNA形質転換への適応性を一段と高めるべく、化学修飾した基質DNAと、人工的に改変した枯草菌宿主の組み合わせにより、基質となる長鎖DNAの取り込み開始位置を指定することにより、DNAを断片の末端から無駄なく取り込むという新規形質転換系の確立をめざし、平成２９年度は以下の研究を行った。
「宿主枯草菌のComEAタンパク質の改変」宿主枯草菌のDNA取り込み装置タンパク質のクラスターであるComGA-GGの７つの遺伝子群にトランスポゾンを利用してランダムにストプトアビジンタンパク質との融合タンパク質を有する組換え枯草菌を作製した。
「末端をビオチン化した基質DNAの形質転換」薬剤耐性遺伝子をコードするDNAの末端をビオチン修飾した評価用化学DNAをPCRにより準備した。これを上記コンピテントセルライブラリーに与えて、ビオチン修飾したDNAが捕捉されることで形質転換が進み、薬剤耐性を持つ形質転換体を得ることが可能かどうかを検証した。多数の形質転換体が得られたが、これらの形質転換体に通常の化学修飾していないDNAを与えても同様に形質転換されたため、ビオチン修飾されたDNAが選択的に取り込まれているとは明確に確認できなかった。
「他のDNA取り込みタンパク質の融合」前年度に作成したDNA結合たんぱく質としてラムダファージのCIリプレッサータンパク質を融合したComEAタンパク質遺伝子を持つ枯草菌に、CIリプレッサータンパク質の認識配列を有するDNAの形質転換を行う実験を繰り返し行ったが、形質転換体は得られなかった。