2017 Fiscal Year Annual Research Report

Proteomic mapping of Yb body in live OSCs via APEX tagging

Research Project

Project/Area Number	16K14666
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	石津大嗣東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (40574588)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords	piRNA / Yb body / プロテオーム
Outline of Annual Research Achievements	piRNAは、相補的な配列を持つレトロトランスポゾンの発現を抑制する生殖細胞特異的な機能性小分子RNAである。ショウジョウバエ生殖細胞において、piRNAはYb bodyと呼ばれる細胞質顆粒構造体で生成されることが示唆されている。Yb bodyは複数のタンパク質とpiRNA前駆体となるRNAから構成されるRNA顆粒体であるが、その構成因子や形成機構に関しては不明な点が多い。本研究では、プロテオーム解析による細胞内RNA顆粒体の網羅的かつ定量的な解析プラットフォームを構築し、Yb body構成因子を同定することでYb bodyにおけるpiRNA生合成機構を明らかにする。これまでに、YbにAPEXを付加したタンパク質をショウジョウバエ卵巣由来培養細胞株OSCにおいて、強制発現し、Yb bodyに局在化するタンパク質のビオチン標識が可能であることを確認した。また、ストレプトアビジンビーズを用いたプルダウンにより、ビオチン標識タンパク質の精製が可能であることがわかった。定量プロテオームの手法としてSILAC法とiTRAQ法を検討したが、OSCではSILAC法で使用する安定同位体標識アミノ酸への置換が困難であることがわかったので、iTRAQ法による解析を進めることに決定した。また、過剰発現によるYb-APEX融合タンパク質の発現では、高いバックグラウンドを生じる可能性があったため、CRISPR-Cas9システムにより内在YbにAPEXを組み込んだノックインOSC株を作製した。