マイクロカプセルを用いた単一細胞解像度bisulfite法の確立

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14667
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 幸田 尚 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (60211893)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: メチルシトシン / エピゲノム / バイサルファイト反応 / マイクロカプセル

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、単一細胞レベルでのエピゲノム解析を行うための基礎的な要素技術の開発を行うものである。メチルシトシン解析のためのbisulfitesequencingは、シトシンをウラシルに変換する反応において同時にDNAの切断が起こるため、微量サンプルからの解析は困難である。本研究では個々の細胞をマイクロカプセルに封入した状態でbisulfite反応を行い、さらにPCR増幅などを行う実験系を構築することによって、単一細胞レベルでのゲノムDNAのシトシン修飾解析の手法を開発することを目的としている。これまでもDNAをアガロースビーズに封入してbisulfite処理を行うことで1細胞からの解析効率を向上する手法が提案されているが、アガロースは高温には耐えられないためそのままPCRを行うことはできなかった。またオイル中に分散した液滴中でPCRを行うエマルジョンPCRという手法も用いられるが、水溶液の液滴は溶液交換が困難であるため、単一の反応を行うことしかできない。本研究ではbisulfite反応とPCRを同一のマイクロカプセル中で続けて行う実験系を確立することにより微量のbisulfite法における解析結果がそもそも何分子のDNAに由来していたかが不明な点を克服すし、bisulfite法の標準的なプロトコールを構築することを目的としている。
そこで本研究ではこれまで多糖類を用いたマイクロカプセル中にDNAを封入し、bisulfite反応を行ってDNAを回収、PCR増幅が可能であることを確認した。今年度は反応系の至適化を行ってbisulfite反応やPCRの効率の最適化を試みた。また、マイクロカプセルにマグネタイト粉末を添加してカプセルを作成し、容易に溶液置換を行う系の構築を試みた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

マイクロカプセルを用いたゲノム上の特定領域におけるbisulfite-sequence法の確立について、初年度に引き続き多糖類を用いたマイクロカプセル中にDNAを封入し、bisulfite反応を行ってDNAを回収し、PCR増幅を行う実験系の検討を行った。DNAを含む液滴を作成するために、スプレーを用いる手法やキャピラリから溶液を滴下する方法などを検討した。しかし、マイクロカプセルの作成条件については、カプセルの直径をコントロールすることが困難で、条件によってはチューブ状の連続的な形状となってしまうものも生じてしまう。マイクロカプセル中の溶液の置換条件を検討するためには均一な直径のマイクロカプセルの作成が必要と考えているが、その制御が困難であるため、研究計画全体に遅延を生じている。

Strategy for Future Research Activity

研究計画全体に遅延を生じており、さらに研究代表者の所属機関変更が重なったため、当初の研究計画期間内に研究を完了することが困難となった。このため、やむなく研究期間の延長を申請した。遅延の最も大きな原因と考えているマイクロカプセルの直径を制御する手法については、DNAを含む液滴を作成するために、キャピラリから溶液を滴下する方法を引き続き検討している。検討の結果、現時点では遠心機を用いて粘性の高い溶液を滴下する方法が最も適切であると考えているが、一定の条件で持続的に液滴を生成するために、これまで用いていたアングルローターによる遠心ではなく、スイングローターを用いること、液面とキャピラリーの距離が大きく変わらないようにすることなどが重要であるとの予備的データが得られた。そこでこれらをさらに検討し、安定的に液滴を生成する条件の確立を計画している。一定程度の安定性が得られれば、多糖類の種類や濃度、キャピラリの直径等の条件を最適化し、実験系の完成を目指す計画である。

Causes of Carryover

マイクロカプセル作成の条件の至適化が十分でないため、当初の研究期間内に研究を完了することができなかった。このため研究期間を延長しマイクロカプセル作成の条件を完成させるとともに、同一マイクロカプセル中での次世代シークエンサーを用いたbisulfite-sequence法に用いるライブラリー作成の実験についてはさらに延長期間中に行うこととし、そのための試薬も含めて次年度での使用額を生ずることとなった。