2017 Fiscal Year Research-status Report
低コスト・高効率な新規ナノ開口基板作製法の開発とDNA結合蛋白質研究への応用
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16K14669
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
韓 龍雲 東京工業大学, 生命理工学院, 研究員 (50566297)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | １分子イメージング / DNA結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA相同組換えは損傷を受けたDNAを修復し、ゲノム構造維持に関与するだけでなく、種に遺伝的多様性を与えることが知られている。Holliday構造DNAはDNA相同組換え中間体である十字型構造をしたDNAであり、このDNAの形成と解消がDNA相同組換えに於いて重要である。本研究計画で解析対象としているRuvA/RuvB/RuvCタンパク質がHolliday構造DNAの解消を担うタンパク質である。蛍光1分子イメージングはこのようなタンパク質の機能解析を行う上で非常に強力な研究手法の一つであるが、RuvA/RuvB/RuvCにおいては100 nM以上の濃度で実験を進める必要があり、本研究では高濃度の蛍光標識生体分子の1分子イメージングを可能とするナノ開口基板を用いて、研究を進めている。
昨年度はCharacter Projection法と呼ばれる高速でナノ加工を可能とする手法を用いて、安価で効率よくナノ開口基板を作製する手法を確立した。また、作製したナノ開口基板を用いた解析を行うために蛍光標識RuvAの作製し、その活性を 物理化学的手法で解析し、これまでの生化学的手法で得られなかったRuvAとRuvBとの結合解離について、新たな結果が得られた。
昨年度から引き続いて、蛍光標識RuvAとRuvBタンパク質を用いて機能解析を行っており、今年度は、RuvBについて新たな結果が得られた。RuvBとRuvAとの相互作用についてはマグネシウムイオン存在下において、RuvA-RuvB複合体がマグネシウムイオン非存在下に比べて安定しているという結果が得られた。また、RuvBの構造がRuvAと相互作用した後に変化していることを示唆する結果も得られ、Holliday構造DNA上でのRuvA-RuvB複合体形成過程を詳細にすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度にCharacter Projection法を用いた安価で効率のいいナノ開口基板作製手法を確立した。 また、作製したナノ開口基板を用いた解析を行うために蛍光標識RuvAの作製を行った。その活性を物理化学的手法で解析し、これまでの生化学的手法で得られなかったRuvAとRuvBとの結合解離について、興味深い結果が得られた。基質である Holliday構造DNA非存在下では、RuvAとRuvBの結合速度は非常に遅いが、Holliday構造DNA存在下ではその結合速度が大きく促進する結果が得られ、今年度は特にRuvBの機能解析を進め、RuvAとRuvBの複合体を形成する過程において、マグネシウムイオンにより、RuvA-RuvB複合体が安定することを示唆する結果を得た。また、この過程において、RuvBはRuvAと相互作用した後に構造変化を起こしていることを示唆する結果も得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度、既にナノ開口基板を効率よく、安価に作製する手法を確立した。そして、DNA相同組換え、特にDNA相同組換え中間体であるHolliday構造DNAの分岐点移動、切断に関与するタンパク質であるRuvA、RuvB、RuvCの機能解析を行っている。今年度はこれまでの研究を継続して、行うだけでなく、可能であれば、他のDNA結合タンパク質、特にエピジェネティクス制御に関連したタンパク質の機能解析を進めていきたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画が順調に進行しており、試薬等の購入が抑えられてこともあり、次年度使用額が生じた。また、今年度は研究計画が順調に進めば、新たなDNA結合タンパク質の解析にも含めた形で研究を進めていき、研究費も研究に合わせて使用する計画である。
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Research Products
(1 results)
