2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of construction for Zero Mode Waveguides with low cost and high efficiency and application to analysis of DNA-binding proteins
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16K14669
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
韓 龍雲 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 研究員 (50566297)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 1分子イメージング / DNA結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ナノ開口基板は100 nm程度の穴がアレイ状に並んだガラス基板で、高濃度蛍光標識生体分子の蛍光１分子イメージングを可能とする。ナノ開口基板作製手法を確立し、これまでにDNA相同組換えの中間体で、十字型構造をしたHolliday構造DNAの分岐点移動を担うモーター蛋白質であるRuvBについて、蛍光標識RuvB蛋白質を作製し、その機能解析を行う中で、RuvAとRuvBがHolliday構造DNAと結合する際において、RuvBのATPとの結合だけでなく、ATP加水分解が安定したRuvA-RuvB-Holliday構造DNA複合体形成を促進することを示唆する結果をえられた。しかしながら、ナノ開口基板を用いた解析を汎用性の高い研究手法とするためには、安価で効率より作製する必要があり、昨年度までにCharacter Projection法と呼ばれる高速でナノ加工を可能とする手法を用いて、コストの面では5分の1程度に抑え、作製枚数については従来の10倍程度まで向上させることに成功し、安価で効率よくナノ開口基板を作製する手法を確立した。今年度は新たに確立した作製手法で作製したナノ開口基板を用いて、蛍光標識Holliday構造DNAをナノ開口基板に固定し、その構造変化をHolliday構造DNA末端に付加した蛍光色素の強度変化を指標に観察することに成功した。また、Holliday構造DNA特異的DNA結合蛋白質であるRuvAについても蛍光標識RuvAの作製にも成功し、これまでに生化学的解析により、RuvA-RuvB-Holliday構造DNA複合体形成におけるRuvAの詳細な機能解析を行うことができた。現在では、RuvAやRuvBを加えることで、Holliday構造DNAの構造変化にどのような影響を与えるのかをHolliday構造DNAに結合した蛍光色素の強度変化を指標にして、解析中である。
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