2017 Fiscal Year Research-status Report
in vitro構築系を用いた動原体-微小管結合インターフェイスの１分子視覚化
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16K14672
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
登田 隆 広島大学, 先端物質科学研究科, 特任教授 (50197894)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
湯川 格史 広島大学, 先端物質科学研究科, 特任助教 (50403605)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | キネトコア / 微小管 / in vitro / TIRF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
姉妹染色分体の二つの娘細胞娘細胞への均等分配は、細胞増殖過程においてもっとも重要な事象であり、生命現象・維持の根幹をなす。その分子レベルでの理解には、染色体分配を担う因子（主にタンパク質と予想される）を一つ一つ同定して、その機能を解析しなければならない。
申請者は遺伝学が容易かつ進化上保存の観点から真核生物のすぐれたモデル系であると広く認知されている分裂酵母を用いて、染色体分配機構を研究してきた。その成果の一つとして、数年前、ヒトまで酵母まで広く保存された動原体（キネトコア）構成タンパク質Ndc80が、分裂酵母内で微小管結合タンパク質Dis1及びAlp7-Alp14複合体と結合することによって、キネトコア-微小管間の強固な接着を保証することを、世界ではじめて示した。すなわちNdc80とこれら微小管結合タンパク質さえ混合すれば、キネトコア－微小管結合インターフェイスにおける特異的結合をin vitroで再現できるのではないかと考えるに至った。
平成２９年度は、キネトコア－微小管結合インターフェイス調節に必須な第3の因子Mal3/EB1微小管結合タンパク質を同定し、その解析を進めた。まず、前年度に確立したin vitro条件下で、Mal3がDis1と直接結合することを発見した。Dis1とAlp14はそれぞれ微小管結合能のみならず、微小管ポリメラーゼ活性を有するが（平成２８年度に示した）、本年度は、Dis1単独とMal3-Dis1複合体におけるポリメラーゼ活性の相違について精査した。その結果、Mal3がDis1の微小管ポリメラーゼ活性を有意に促進させることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究により、Mal3/EB1とDis1が直接相互作用することが示された。さらにDis1タンパク質内におけるMal3/EB1結合領域の詳細な探索を介して、結合に必須なアミノ酸残基の同定にまで成功した。これらの結果は、分裂酵母における最初の知見である。興味深いことに、このDis1-Mal3/EB1の結合様式が、実はヒトを含む高等生物でもアミノ酸レベルで高度に保存されていることが、他のグループの後追い実験によって独立に明らかとなった。すなわち、本研究によって、今まで不明であった二つの微小管タンパク質同士の直接相互作用の存在、さらにその分子レベルでの結合メカニズムを明らかにすることができた。これら新知見を他の生物、研究者に先駆けて発見できたことにより、現在までの「研究進捗状況」の自己評価として（２）おおむね順調に進んでいるとした。
本年度の研究結果におけるもう一点重要な知見は、今まで単独で機能すると思われていた微小管ポリメラーゼが、実はもう一つのタンパク質と複合体を形成することを示したことである。すなわちAlp7とAlp14、Dis1とMal3間の複合体の同定である。前述したように、Mal3がDis1の微小管ポリメラーゼを促進することは示した。現在、Alp7がAlp14の微小管ポリメラーゼ活性にどのようなインパクトをもつか、in vitroで解析中である。ポリメラーゼ活性検出の最適条件については、さらに検討の余地を残す。その次のステップとして、Ndc80複合体と直接結合するのは、Alp7、Alp14、Dis1、Mal3のどのタンパク質（複合体も含めて）かを、in vitro実験及び分裂酵母抽出液を用いた免疫免疫沈降法、pull-down法により鋭意解析していく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）Alp7-Alp14複合体、Dis1-Mal3複合体の生化学・生物物理的解析
Alp14、Dis1がそれぞれ微小管ポリメラーゼ活性を持つことを示すことができた。しかしその活性値は予想に比して、低いものであった。この原因を究明するため、反応条件の詳細な検討、最適条件の探索が必須である。Alp1４はAlp7と、Dis1はMal3と複合体を形成する。今回確立したin vitro系にAlp7、Mal３を加えてAlp7-Alp14、およびMal3-Dis1複合体のポリメラーゼ活性を測定する必要がある。
２）Ndc80複合体の再構築：現在既に４つのサブユニット発現系はほぼ完成の状態にある。大腸菌でこれらを同時に発現させ、複合体形成・精製にまでもっていきたい。その後はNdc80複合体の微小管結合能の査定、それにさらにDis1(+Mal3)、Alp14(+Alp７)を混合し、Ndc80の微小管上での挙動に変化が見られるか。さらに微小管ダイナミクスが促進されるかどうかという本申請の本題へと研究を伸展されていく計画である。予想される困難としてはNdc80複合体が大腸菌では、不溶性・低発現のため、in vitro再構築ができない可能性である。その問題に対処するためbaculo系（Baculovirus Expression Vector System）の使用も視野に入れてなければならないと考えている。
３）Ndc80-Nuf2二量体の微小管結合解析
ヒトではNdc8-Nuf2二量体が強い微小管結合能をもつことが知られている。２）で調整する分裂酵母のNdc8-Nuf2微小管結合能を詳細に解析予定である。特に微小管のプラス端との特異的相互作用があるか、種々の条件-バッファー組成、タンパク質濃度、温度-を検討しなければならない。
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| Causes of Carryover |
DNA修飾酵素をキャンペーン価格で購入したため、値段が安くなり、約1905円が次年度先送りとなった。
大腸菌からのタンパク質精製のための酵素購入に充てる。
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[Journal Article] A microtubule polymerase cooperates with the kinesin-6 motor and a microtubule cross-linker to promote bipolar spindle assembly in the absence of kinesin-5 and kinesin-14 in fission yeast2017
Author(s)
Yukawa, M., Kawakami, T., Okazaki, M., Kume, K., Tang, N.H., and Toda, T.
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Journal Title
Mol Biol Cell
Volume: 28
Pages: 3647-3659
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body2017
Author(s)
Tang, N.H., Fong, C.S., Jourdain, I., Masuda, H., Yukawa, M., and Toda, T.
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Journal Title
PeerJ Preprints
Volume: 5
Pages: e3377v1
DOI
Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Identification of three signaling molecules required for calcineurin-dependent monopolar growth induced by the DNA replication checkpoint in fission yeast2017
Author(s)
Kume, K., Hashimoto, T., Suzuki, M., Mizunuma, M., Toda, T., & Hirata, D.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun
Volume: 491
Pages: 883-889
DOI
Peer Reviewed
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