グアニン４重鎖とRif1蛋白質を用いた染色体ループ構造の改変によるゲノム機能操作

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14675
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 副所長 (40229349)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 染色体ループ構造 / ゲノム改変 / グアニン4重鎖 / Rif1 / 染色体核内配置 / DNA結合

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、進化的に保存された核タンパク質Rif1と、その結合標的であるグアニン４重鎖構造を利用して、クロマチンループ構造の人為的改変を介して核内染色体高次構造を操作し、ゲノムの機能改変を誘導する新規技法を開発する。この提案は、申請者が複製タイミング制御の決定因子として同定したRif1の作用機序に関する最新の発見に基づいている。
Rif1を用いて、染色体の核内配置や高次構築を操作するために、１．発現レベルを変動することによりゲノム全体のクロマチンループ構造を操作する、２．部位特異的にクロマチンループを形成し、局所的に染色体機能ドメインを操作する、の二つのアプローチをとる。
１．を達成するためにRif1遺伝子のプロモーター領域にCas9/CRISPRで変異を導入し、プロモーター活性が変動した細胞株を樹立する。２．を達成するために、（１）転写プロモーター＋G4構造をゲノム上の標的領域の両側に挿入する、及び（２）特異性を改変したRif1タンパク質＋標的G4構造をゲノム上に挿入する、の２つのアプローチをとる。
これまで、２．に関して誘導可能なプロモーターの下流にRif1結合部位（Rif1BS）に由来するG4構造形成配列を配置し分裂酵母ゲノム上に導入した。その結果、Rif1の結合が観察されたが、転写を誘導してもしなくても観察された。これは導入した領域が、近傍にある内在性のプロモーターから構成的に転写されているからかもしれない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

動物細胞においてCas9/CRISPRを用いてRif1プロモーターへの変異の導入を行っているが、理由は不明であるが、変異導入の効率が著しく低い。非コード領域は複雑に転写されていることから、ゲノムレベルで転写レベルを正確にコントロールするのはなかなか困難であるという印象を受けた。

Strategy for Future Research Activity

分裂酵母を用いてRif1のpromoterを効率の異なる３つのプロモーターに置き変えてそのクロマチン構造、複製タイミングなどへの影響を調べる。強いRif1BSの存在しない領域（初期複製起点が集まっている領域）にRif1BSを１個あるいは２個導入し、Rif1の結合、それに挟まれる領域のDNA複製タイミング、転写活性などを解析する。
また、強いRif1BSのひとつを、配列や、トポロジーの異なるG4配列に置き換えて、Rif1の細胞内での結合を測定する。in vitroにおけるRif1の結合と細胞内における結合の相関を調べる。細胞内での、G4配列へのRif1の結合に依存した転写活性化測定系（one hybrif assay系）を確立する。これをを見出されてたらrandom mutagenesisにより結合できないG4に結合できるようになったRif1変異体をスクリーニングする。

Causes of Carryover

Cas9/CRISPRを用いた変異の導入の効率が著しく低く、実験の進行が遅延した。そのため次のステップに必要な　DNA単離、塩基配列決定などの試薬の購入を行わなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

Cas9/CRISPRを用いた変異導入の確認に必要な試薬の購入に用いる予定である。

Research Products

• [Journal Article] Checkpoint-independent Regulation of Origin Firing by Mrc1 through Interaction with Hsk1 kinase. (2017)
  • Author(s): Matsumoto, S., Kanoh, Y., Shimmoto, M., Hayano, M., Ueda, K., Fukatsu, R., Kakusho, N., and *Masai, H.
  • Journal Title: Mol. Cell. Biol. Volume: 37 Pages: e00355-16.
  • DOI: 10.1128/MCB.00355-16.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment of expression-state boundaries by Rif1 and Taz1 in fission yeast. (2017)
  • Author(s): Toteva, T., Mason, B., Kanoh, Y. Brogger, P. Green, D., Verhein-Hansen, J. Masai, H. and Thon, G.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A. Volume: 114 Pages: 1093-1098
  • DOI: 10.1073/pnas.1614837114.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Potent DNA strand annealing activity associated with mouse Mcm2~7 heterohexamer complex. (2017)
  • Author(s): You, Z. and Masai, H.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Telomere binding factors in regulation of DNA replication. (2017)
  • Author(s): Masai, H., Kanoh, Y., Moriyama, K., Yamazaki, S., Yoshizawa, N., and Matsumoto, S.
  • Journal Title: Genes & Genetic Systems Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel p53-Cdc7 link induced by genotoix stress. (2017)
  • Author(s): Masai, H.
  • Journal Title: Cell Cycle Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1080/15384101.2017.1304746.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mrc1/Claspin: a new role for regulation of origin firing. (2017)
  • Author(s): Masai, H., Yang, C-C., and Matsumoto, S.
  • Journal Title: Current Genetics Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s00294-017-0690-y.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of conserved arginine residues on Cdt1 that affect licensing activity and interaction with Geminin or Mcm complex. (2016)
  • Author(s): You Z, Ode KL, Shindo M, Takisawa H, Masai H.
  • Journal Title: Cell Cycle. Volume: 15 Pages: 1213-1226
  • DOI: 10.1080/15384101.2015.1106652.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fork restart protein, PriA, binds around oriC after depletion of nucleotide precursors: Replication fork arrest near the replication origin. (2016)
  • Author(s): Tanaka T, Nishito Y, Masai H.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 470 Pages: 546-551
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.01.108.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epigenetic Regulation of the Blimp-1 Gene (Prdm1) in B Cells Involves Bach2 and Histone Deacetylase 3. (2016)
  • Author(s): Tanaka H, Muto A, Shima H, Katoh Y, Sax N, Tajima S, Brydun A, Ikura T, Yoshizawa N, Masai H, Hoshikawa Y, Noda T, Nio M, Ochiai K, Igarashi K.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 291 Pages: 6316-6330
  • DOI: 10.1074/jbc.M116.713842.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phosphorylation of TAR DNA-binding Protein of 43 kDa (TDP-43) by Truncated Casein Kinase 1δ Triggers Mislocalization and Accumulation of TDP-43. (2016)
  • Author(s): Nonaka T, Suzuki G, Tanaka Y, Kametani F, Hirai S, Okado H, Miyashita T, Saitoe M, Akiyama H, Masai H, Hasegawa M.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 291 Pages: 5473-5483
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.695379.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Overexpression of eIF5 or its protein mimic 5MP perturbs eIF2 function and induces ATF4 translation through delayed re-initiation. (2016)
  • Author(s): Kozel, C., (他19名), Masai, H., Wagner, G., Beeser, A., Kikkawa, U., Fleming, S.D., and Asano, K.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 44 Pages: 8704-8713
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Claspin recruits Cdc7 kinase for initiation of DNA replication in human cells. (2016)
  • Author(s): Yang, C-C., Suzuki, M., Yamakawa, S., Uno, S., Ishii, A., Yamazaki, S., Fukatsu, R., Fujisawa, R., Sakimura, K., Tsurimoto, T., and Masai, H.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 7 Pages: 12135
  • DOI: 10.1038/ncomms12135.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] グアニン４重鎖構造の普遍的生物学的意義の解明に向けて (2016)
  • Author(s): 正井 久雄
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-12-02 – 2016-12-02
  • Invited
• [Presentation] Rif1によるグアニン４重鎖構造を介した DNA複製制御 (2016)
  • Author(s): 加納 豊
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] Rif1過剰発現は染色体分配の障害を誘導しM期進行を阻害する (2016)
  • Author(s): 松本 清治
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] Novel higher-order DNA structures containing G-quadruplex structures on both strands of Rif1 binding region play a crucial role in determination of replication timing domain (2016)
  • Author(s): Masai, H.
  • Organizer: 第10回3R国際シンポジウム
  • Place of Presentation: ホテル一畑(島根県松江市)
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Rif1 interacts with chromatin through G-quadruplex and regulates DNA replication (2016)
  • Author(s): Kanoh, Y.
  • Organizer: 第10回3R国際シンポジウム
  • Place of Presentation: ホテル一畑(島根県松江市)
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] G4 binding domain of fission yeast Rif1 protein (2016)
  • Author(s): Kobayashi, S.
  • Organizer: 第10回3R国際シンポジウム
  • Place of Presentation: ホテル一畑(島根県松江市)
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Multimer formation and G-quadruplex-binding by purified murine Rif1, a key organizer of higher-order chromatin architecture (2016)
  • Author(s): Moriyama, K.
  • Organizer: 第10回3R国際シンポジウム
  • Place of Presentation: ホテル一畑(島根県松江市)
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cellular dynamics of G-quadruplex structures and RNA-DNA hybrid in human cells (2016)
  • Author(s): Nishitomi, T.
  • Organizer: 第10回3R国際シンポジウム
  • Place of Presentation: ホテル一畑(島根県松江市)
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Genome-wide distribution of G-quadruplex structures and RNADNA hybrids on the E. coli genome (2016)
  • Author(s): Seki, Y.
  • Organizer: 第10回3R国際シンポジウム
  • Place of Presentation: ホテル一畑(島根県松江市)
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] グアニン４重鎖構造の生物学的意義 Biological Roles of G-quadruplex (2016)
  • Author(s): 正井 久雄
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-08 – 2016-10-08
  • Invited
• [Presentation] グアニン４重鎖の形成と、その認識タンパク質との相互作用 (2016)
  • Author(s): 正井 久雄
  • Organizer: 第89回 日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター/東北大学(宮城県仙台市)
  • Year and Date: 2016-09-26 – 2016-09-26
  • Invited
• [Presentation] 大腸菌染色体の第二の複製システム (2016)
  • Author(s): 正井 久雄
  • Organizer: 第88回日本遺伝学会大会
  • Place of Presentation: 日本大学（静岡県三島市）
  • Year and Date: 2016-09-09 – 2016-09-09
  • Invited
• [Presentation] 大腸菌の第二の複製システムから考える複製システムの進化 (2016)
  • Author(s): 正井 久雄
  • Organizer: 日本進化学会 第18回東京大会
  • Place of Presentation: 東京工業大学大岡山キャンパス（東京都目黒区）
  • Year and Date: 2016-08-27 – 2016-08-27
  • Invited
• [Presentation] グアニン４重鎖構造の生物学的意義Molecular basis of chromosome and genome instability in cancer (2016)
  • Author(s): Masai, H.
  • Organizer: HiHA 第 6 回 Workshop Hiroshima Research Center for Healthy Aging
  • Place of Presentation: 広島大学（広島県東広島市）
  • Year and Date: 2016-07-08 – 2016-07-08
  • Invited
• [Presentation] Biological roles of G-quadruplex structures (2016)
  • Author(s): Masai, H.
  • Organizer: 14th IGAKUKEN International Symposium IGAKUKEN Summit for Japan and Korea Science Leaders 2016
  • Place of Presentation: 東京都医学総合研究所（東京都世田谷区）
  • Year and Date: 2016-06-30 – 2016-07-01
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Interaction with G-quadruplex structures forms a basis for Rif1-mediated regulation of DNA replication, transcription and chromatin architecture (2016)
  • Author(s): Masai, H.
  • Organizer: Cold Spring Harbor Asia conference on DNA Metabolism, Genomic Stability and Human Disease
  • Place of Presentation: Suzhou(China)
  • Year and Date: 2016-06-13 – 2016-06-17
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] 公益財団法人東京都医学総合研究所ゲノム動態プロジェクト
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/genome/