2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞の外と内とで蛋白質捕捉活性がオフからオンに切り替わる機能性RNAの創製
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16K14678
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
片平 正人 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 機能性核酸 / 構造変化 / FRET / スイッチング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞外におけるK+濃度は約5 mM であるのに対し、細胞内では約100 mMである。そのため、K+濃度を感知して自らの活性を制御できる機能性RNA は、細胞の内と外で活性を切り替え可能な分子ツールと成り得、核酸医薬品やドラッグデリバリーシステムへの応用が期待できる。
r(GGA)3GG 配列をもつRNA(以下R11 と呼ぶ)は、K+非存在下では伸びた一本鎖状態であるが、K+存在下ではコンパクトな四重鎖構造を形成する。Tat 結合RNA アプタマー(RNA アプタマーは標的分子に高い親和性を示すRNA のこと)を2 つのサブユニットに分割し、これらの間にR11 を挿入することで、K+依存的に活性がオンとなる四重鎖Tat 結合アプタマー(QTAp)を開発した。QTAp はK+非存在下ではTat 蛋白質の部分ペプチドと結合しないが、K+存在下ではTat ペプチドとの結合活性を示した。つまり、K+を感知することでTat捕捉活性がオンへとスイッチした。さらに、QTAp およびQHR は細胞外で高濃度に存在するNa+では活性化されず、細胞の内外で活性をスイッチング可能な機能性RNA の開発に適していることも分かった。
また機能性核酸によるタンパク質の大きな構造変化を、上記の解析でも用いたFRET法によって捉える事に成功した。
さらに同様にR11 を挿入することで、四重鎖ハンマーヘッドリボザイム(QHR) (リボザイムは酵素活性を有するRNA のこと)を開発した。QHR は、K+非存在下に比べ、K+存在下では標的RNA 切断活性が上昇した。QHR の場合、単独ではK+非存在下であっても活性が残存していたが、QHR に対する相補鎖を導入し、二重鎖とすることでこの残存活性を抑制する事ができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
機能性核酸の活性を、イオン強度に応じてスイッチングする事に成功した。また機能性核酸によるタンパク質の大きな構造変化を、FRET法によって捉える事にも成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
イオン強度を繰り返し上下させた際に、機能性核酸の活性のオンとオフが繰り返して生じる事を検証する。また機能性核酸によるタンパク質の構造変化に関し、より定量的な情報を得る。
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| Causes of Carryover |
機能性核酸に活性のスイッチング能を付与する研究が順調に進んだ為、調製する核酸の量が当初予定より少なく済んだ為。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞を用いた実験に加え、機能性核酸によるタンパク質の大きな構造変化を定量的に計測する実験に、助成金を用いる。
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Research Products
(4 results)
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[Presentation] Development of K+-responsive RNA aptamer and ribozyme, and in-cell NMR of nucleic acids in human cells2017
Author(s)
Yamaoki, Y., Kiyoishi, A., Mashima, T., Kano, F., Murata, M., Nagata, T. and Katahira, M.
Organizer
International Symposium for NMR of Nucleic Acids
Place of Presentation
Ｇｙｅｏｎｓａｎｇ (韓国）
Year and Date
2017-01-17
Int'l Joint Research
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[Presentation] NMR studies of non-coding RNA and DNA recognition by TLS/FUS which induces transcriptional repression of cyclin D1 and telomere shortening2016
Author(s)
Kondo, K., Mashima, T., Oyoshi, T., Yoneda, R., Kurokawa, R., Nagata, T. and Katahira, M.
Organizer
The XXVIIth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
Place of Presentation
京都国際会議場（京都）
Year and Date
2016-08-21 – 2016-08-26
Int'l Joint Research
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