2018 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of rotary ion transport mechanism of V-ATPase by visualization and control of substrate
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16K14706
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上野 博史 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (10546592)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 1分子計測 / 分子モーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
回転分子モーターV-ATPaseの回転によるイオン輸送機構を1分子計測により明らかにすることが本研究の目的である。具体的にはまずナトリウム（Na+）を輸送基質とするEnterococcus hirae (E. hirae)由来のV-ATPase（VoV1）のATP駆動の回転を様々なNa+濃度で1分子計測し、Na+結合・解離に共役したVo由来の回転ステップを実証する。次にNa+濃度変化に対する回転の挙動の変化を定量的に解析し、回転ステップに関わる素過程反応の数や種類、反応の時定数を決定する。さらに平面支持膜実験系におけるNa+濃度の計測方法、Na+濃度差・膜電位の制御法を新規に開発し、膜電位やNa+濃度差に対する回転の応答を調べ、Voにおける回転イオン輸送機構の解明を目指した。まずサンプルに用いるE. hirae VoV1の大腸菌内発現系・精製系の最適化を行い、高活性なE. hirae VoV1を安定的に調製できる発現系・精製系の構築に成功した。このサンプルを用いた電子顕微鏡解析によりE. hirae VoV1全体の構造解析にも成功している。このE. hirae VoV1を用いて、ATP駆動回転の高時間分解能（サブミリ秒）での検出にも成功した。さらにE. hiraeのVoV1は可溶化状態においても外部のナトリウム濃度の低下に伴い回転速度が低下することが明らかになった。いくつかの分子は、低ナトリウム濃度条件において、9～10点の多点の回転ステップを示した。このステップ数は、E. hirae VoV1のVo部位の構造から予想される回転ステップサイズ（360°/c10=36°）と近い値であることから、観察されたステップ回転はVoでのナトリウム結合を反映したものであると考えられる。しかしながら、停止時間に比べて停止状態の角度揺らぎが大きく解析が困難であった。そこで固定タグの位置を位置を変えた変異体を複数作製したが、最終的に定量的な解析には至らなかった。
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