2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of Protein-based Molecular Probes for Oxygen Concentration
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16K14712
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
石川 春人 大阪大学, 理学研究科, 講師 (40551338)
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2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオイメージング / 蛍光エネルギー移動 / 低酸素応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酸素は生体内においてエネルギー産生のみならず、低酸素環境への応答であるシグナル伝達など 様々な役割を果たしている。この酸素による制御や影響を検討するためには、酸素濃度の変化を可視化するプローブ分子の開発が重要である。これまで、金属錯体を基盤としたイメージングプ ローブ分子の開発が行われているが、タンパク質を基盤とした実用性の高いイメージングプローブの報告はなかった。本研究ではヤツメウナギヘモグロビン(slHb)が酸素濃度依存的なモノマー/ダイマー平衡を示すことに着目し、タンパク質を基盤とした酸素濃度依存的 FRETシグナルを検出可能 なイメージングプローブタンパク質を創製を目指した。
slHbをそれぞれドナーおよびアクセプターとなる蛍光有機小分子によりラベルした系では、酸素濃度依存的なFRETシグナルが観測されたが、得られたFRETシグナルは想定より弱かった。これはドナー/ドナーやアクセプター/アクセプターのホモダイマー形成により、本来の設計に従ったドナー/アクセプターのペア形成が妨げられた可能性が高い。この問題を解決するために、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質を含め、全てを一本のポリペプチド鎖として発現することで、ホモダイマー形成を防ぐことを目指した。融合タンパク質（ドナー蛍光タンパク質ーslHbーリンカーーアクセプター蛍光タンパク質ーslHb）の大腸菌用発現プラスミドを作成し、実際に発現・精製を試みた。しかし、この融合タンパク質は大腸菌内で発現せず、精製は不可能であった。そこで、新たにドナー蛍光タンパク質ーslHbとアクセプター蛍光タンパク質ーslHbの融合遺伝子を組み込んだプラスミドを調整し、大腸菌での発現を試みたところ融合タンパク質を得ることができた。この新規融合タンパク質によるイメージング測定が今後の目標である。
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