１分子解析によるプロトン駆動型輸送モーターの動態探査

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14713
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 塚崎 智也 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (80436716)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 蛋白質 / タンパク質の膜透過 / トランスロコン / 膜タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

細菌の生育に重要な役割をになうタンパク質としてプロトン駆動型モータータンパク質SecDFがある。このSecDFは、タンパク質膜透過チャネルであるトランスロコンと相互作用して複合体を形成する膜タンパク質である。トランスロコンを経由する生命必須の現象であるタンパク質の膜を超えた輸送に関わる。SecDFはプロトンの濃度勾配を利用して、大きな構造変化を伴いながらタンパク質の輸送に関わるとされている。本研究では、そのSecDFの可動性領域がどのように機能するかを明らかとすべく、高速原子間力顕微鏡を用いて１分子のSecDFをリアルタイムで解析した。その結果，SecDFの構造変化の平衡状態はバッファーのpHなどに依存する可能性があるとの予備的な結果を得た。また、SecDFのプロトン透過活性を詳細に調べるため，高いpH感受性のGFPと、SecDFを大腸菌内に発現させ、SecDFが過剰発現させた大腸菌がどの程度プロトンを通すのかについて検討を行った。プロトンの透過と、可動性領域が密接に関連していることを明らかとした。これらの動態観察と、SecDFの結晶構造解析の結果を統合し、SecDFの新規のモデルを提唱した。SecDFは、少なくとも２つの状態(I型、F型)構造をとり、膜透過の中間体の状態はI型構造であるとした。I型構造では基質と強く相互作用し、プロトンの力を使いながら、基質タンパク質を細胞外へ引っ張ると考えられた。SecDFはI型、F型の構造変化を繰り返し段階的にタンパク質の膜透過に関与していることが考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画にそって順調に進めている。本年度はSecDFの動態に関する知見をえて、構造解析の結果と統合してSecDFの分子メカニズムを提唱した。

Strategy for Future Research Activity

SecDFの動的メカニズムに迫るため、今後はSecDFのリアルタイム動態観察を主軸とした実験と、プロトンの濃度勾配から運動へのエネルギー変換についての知見をえるためSecDFの変異体の機能解析等を進める。SecDFのリアルタイム動態観察には、高速原子間力顕微鏡ならびに蛍光１分子観察を進める。高速原子間力顕微鏡では外部の構造変化を、蛍光一分子では分子内部の構造変化を見出す。SecDFについては、反復運動を行なっているのか回転運動をおこなっているのか、未だ不明である。まずは、この変化を見出し、次に詳細なドメインの構造変化を追跡していく。エネルギー変換については、どれだけのプロトンがSecDFの構造変化に必要であるのかについては情報がない。これを明らかとするためには定量的な生物物理学的な手法でのアプローチする。１分子のタンパク質によるプロトンの流入を測定できるマクロ装置が開発されており、その装置を用いてSecDFによるプロトン透過の測定を行う。SecDFは膜へと再構成し、そのマイクロ装置に展開させる。SecDF１分子による蛍光変化については、蛍光をもちいて定量的に観察する。系を組むことができれば、プロトン透過活性を失った変異体や、可動性を失った変異体を用いるなど、一連の変異体解析によって、SecDFのプロトン透過についての詳細な情報を得る。これら実験を通して、SecDFの作業機序を明らかとする。

Causes of Carryover

本実験計画では、タンパク質の精製と測定が主な実験手法である。特にタンパク質の精製過程に使用する界面活性剤などの金額が高価である。本年度は、予定よりも測定の予備実験である条件検討に多くの時間を費やしたため、タンパク質の精製の回数が予定より減少したため、次年度使用額を生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今年度は、測定に適したサンプル調整のため、予定より多くの変異体のタンパク質を精製し測定に用いる。繰越分の予算はタンパク質精製のための消耗品に利用する。

Research Products

• [Journal Article] Tunnel formation inferred from the I form structures of the proton-driven protein secretion motor SecDF (2017)
  • Author(s): Arata Furukawa, Kunihito Yoshikaie, Takaharu Mori, Hiroyuki Mori, Yusuke V. Morimoto, Yasunori Sugano, Shigehiro Iwaki, Tohru Minamino, Yuji Sugita, Yoshiki Tanaka, Tomoya Tsukazaki
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 共生細菌由来MATE様多剤排出トランスポーターの結晶化 (2017)
  • Author(s): 谷口 勝英, 藤本 圭, 田中 良樹, 塚崎 智也
  • Organizer: 第９０回 日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2017-03-19 – 2017-03-21
• [Presentation] 膜輸送装置の構造と機能 (2017)
  • Author(s): 田中 良樹, 古川 新, 森 貴治, 森 博幸, 森本 雄祐, 菅野 泰功, 岩木 薫大, 南野 徹, 杉田 有治, 塚﨑 智也
  • Organizer: 第９０回 日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2017-03-19 – 2017-03-21
  • Invited
• [Presentation] Snapshots of the proton-driven protein translocation motor (2017)
  • Author(s): Arata Furukawa, Kunihito Yoshikaie, Takaharu Mori, Hiroyuki Mori, Yusuke V. Morimoto, Yasunori Sugano, Shigehiro Iwaki, Tohru Minamino, Yuji Sugita, Yoshiki Tanaka, Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: EMBO conference | Protein translocation and cellular homeostasis
  • Place of Presentation: Hotel Valamar Lacroma (クロアチア・ドブロブニク)
  • Year and Date: 2017-03-18 – 2017-03-22
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Cytoplasmic insights of protein-conducting channel implied from the crystal structures of SecYEG (2017)
  • Author(s): Yasunori Sugano, Arata Furukawa, Yoshiki Tanaka, Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: EMBO conference | Protein translocation and cellular homeostasis
  • Place of Presentation: Hotel Valamar Lacroma (クロアチア・ドブロブニク)
  • Year and Date: 2017-03-18 – 2017-03-22
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 大腸菌のペリプラズムプロテアーゼBepAは、TPR domainを介した タンパク質間相互作用により外膜機能を維持する (2017)
  • Author(s): 大門 康志, 舛井 千草, 宮﨑 亮次, 櫻田 洋人, 田中 良樹, 鈴木 健裕, 堂前 直, 森 博幸, 塚崎 智也, 成田 新一郎, 秋山 芳展
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 名古屋大学（愛知県・名古屋市）
  • Year and Date: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [Presentation] Secトランスロコンを介した膜透過の高速AFM観察 (2017)
  • Author(s): 春山 隆充, 菅野 泰功, 田中 良樹, 紺野 宏記, 塚崎 智也
  • Organizer: 平成28年度 生物物理学会中部支部 講演会
  • Place of Presentation: 名古屋大学（愛知県・名古屋市）
  • Year and Date: 2017-03-06
• [Presentation] タンパク質膜透過を駆動するモータータンパク質のスナップショット (2017)
  • Author(s): 古川 新, 吉海江 国仁, 森 貴治, 森 博幸, 森本 雄祐, 菅野 泰功, 岩木 薫大, 南野 徹, 杉田 有治, 田中 良樹, 塚崎 智也
  • Organizer: 2017年 生体運動研究合同班会議
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県・神戸市）
  • Year and Date: 2017-01-06 – 2017-01-08
• [Presentation] Snapshots of a protein translocation motor (2016)
  • Author(s): 古川 新, 吉海江 国仁, 森 貴治, 森 博幸, 森本 雄祐, 菅野 泰功, 岩木 薫大, 南野 徹, 杉田 有治, 田中 良樹, 塚崎 智也
  • Organizer: 第５４回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25 – 2016-11-27
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular mechanisms underlying proton transport in SecDF (2016)
  • Author(s): Takaharu Mori, Yoshiki Tanaka, Kunihito Yoshikaie, Tomoya Tsukazaki, Yuji Sugita
  • Organizer: 第５４回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25 – 2016-11-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cytoplasmic insights of protein-conducting channel implied from the crystal structures of SecYEG (2016)
  • Author(s): Arata Furukawa, Yasunori Sugano, Yoshiki Tanaka, Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: Zing conferences: Protein Secretion in Bacteria Conference 2016
  • Place of Presentation: Sirata Beach Resort Tampa, Florida. USA
  • Year and Date: 2016-11-09 – 2016-11-12
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Snapshots of the proton-driven protein translocation motor (2016)
  • Author(s): Arata Furukawa, Kunihito Yoshikaie, Yasunori Sugano, Yoshiki Tanaka, Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: Zing conferences: Protein Secretion in Bacteria Conference 2016
  • Place of Presentation: Sirata Beach Resort Tampa, Florida. USA
  • Year and Date: 2016-11-09 – 2016-11-12
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Snapshots of a proton-driven protein translocation motor (2016)
  • Author(s): Tomoya Tsukazaki, Kunihito Yoshikaie, Arata Furukawa, Yasunori Sugano, Yoshiki Tanaka
  • Organizer: The 42nd Naito Conference on In the Vanguard of Structural Biology: Revolutionizing Life Sciences
  • Place of Presentation: シャトレーゼ ガトーキングダム サッポロ（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-10-04 – 2016-10-07
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 分子シミュレーションによるタンパク質透過チャネル因子 SecG の構造揺らぎの解析 (2016)
  • Author(s): 森 貴治, 塚崎 智也, 杉田 有治
  • Organizer: 日本物理学会 2016年秋季大会
  • Place of Presentation: 金沢大学角間キャンパス（石川県・金沢市）
  • Year and Date: 2016-09-13 – 2016-09-16
• [Presentation] Complete and Peptide-bound Structures of the Sec translocon (2016)
  • Author(s): Yoshiki Tanaka, Yasunori Sugano, Mizuki Takemoto, Takaharu Mori, Arata Furukawa, Tsukasa Kusakizako, Ryuichiro Ishitani, Yuji Sugita, Osamu Nureki, Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: Nascent Chain Biology Meeting 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県・富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-02 – 2016-09-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Secトランスロコンの１ユニット再構成系の構築と動的探査 (2016)
  • Author(s): 菅野 泰功, 春山 隆充, 田中 良樹, 紺野 宏記, 塚崎 智也
  • Organizer: 第１６回日本蛋白質科学会 年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-06 – 2016-06-09
• [Presentation] タンパク質膜透過チャネルSecYEGにおけるSecGの役割-分子動力学計算によるアプローチ- (2016)
  • Author(s): 森 貴治, 塚崎 智也, 杉田 有治
  • Organizer: 第１６回日本蛋白質科学会 年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-06 – 2016-06-09
• [Presentation] 新生鎖を膜透過させるSec蛋白質のＸ線結晶構造解析 (2016)
  • Author(s): 田中 良樹, 菅野 泰功, 武本 瑞貴, 森 貴治, 古川 新, 吉海江 国仁, 草木迫 司, 熊崎 薫, 鹿島 絢子, 石谷 隆一郎, 杉田 有治, 濡木 理, 塚崎 智也
  • Organizer: 第１６回日本蛋白質科学会 年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-06 – 2016-06-09
  • Invited
• [Presentation] SecDFの構造変化 (2016)
  • Author(s): 吉海江 国仁, 菅野 泰功, 田中 良樹, 塚崎 智也
  • Organizer: 第13回 21世紀大腸菌研究会
  • Place of Presentation: グリーンピア南阿蘇（熊本県・南阿蘇村）
  • Year and Date: 2016-06-02 – 2016-06-03
• [Presentation] 蛋白質分泌マシーナリーの動的精密探査に向けて (2016)
  • Author(s): 菅野 泰功, 春山 隆充, 田中 良樹, 紺野 宏記, 塚崎 智也
  • Organizer: 第13回 21世紀大腸菌研究会
  • Place of Presentation: グリーンピア南阿蘇（熊本県・南阿蘇村）
  • Year and Date: 2016-06-02 – 2016-06-03
• [Remarks] 奈良先端科学技術大学院大学 バイオサイエンス研究科 塚崎研 研究業績
  • URL: http://bsw3.naist.jp/tsukazaki/publication.html