2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K14716
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
佐甲 靖志 国立研究開発法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 主任研究員 (20215700)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞情報・動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、顕微ラマン分光法で細胞内化学種組成の細胞間分布と単一細胞内時間ゆらぎを計測し、成長因子など外来信号に対する細胞応答性との関係を調べることによって、化学組成で定義される細胞状態の違いが細胞応答を決定し、さらに細胞の個別性を生み出す過程を明らかにすることを目的としている。
我々は最近、単一細胞の細胞質から得られるラマン散乱スペクトルの時系列計測を行い、細胞質の化学種組成が10分程度の時間スケールで激しくゆらいでいることを発見した。細胞群は、化学種組成の異なる集団に分類でき、集団ごとに、ゆらぎの性質や成長因子に対する応答が異なっている。この発見を本研究の目的に沿って発展させるには、長期間の細胞応答を個々の細胞毎に持続的に分光計測するシステムの開発が必要であるが、現在市販のラマン分光顕微鏡装置は正立顕微鏡を本体とし、培養細胞観察では培養液に直接浸漬する対物レンズを用いる。この方法では無菌的環境を持続することが困難であり、長期間の細胞培養観察に不向きである。通常の培養環境(37度、5% CO2)を保つことも難しい。従って今回の研究には新たな顕微鏡システムが必要である。本年度は倒立顕微鏡を本体とする長期細胞観察が可能な計測システムの開発を行い、一応の完成を見た。計測条件の最適化を行い、作成したシステムを用いてMCF-7細胞のheregulinによる分化状態を計測したところ、ラマンスペクトルに基づいて分化・未分化状態を区別することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
倒立顕微鏡を本体とし、ステージ上に細胞培養装置を備えたラマン分光顕微鏡を自作した。532 nm のレーザー光を光源として試料上を連続的に直線走査し、顕微鏡を通して対応する位置に置いたスリットを通るラマン散乱を分光して冷却CCDカメラ上にx-lambda像を取得する半共焦点型とした。試料増は別の顕微鏡ポートからもう一台の冷却CCDカメラで撮像し、ステップモーターで試料をx-y走査しながら断続的に試料像撮影と分光計測を行う。顕微鏡上で５日間以上の培養が可能になったが、レーザー光による障害のため、１細胞からは20回程度のスペクトル取得が限界である。（我々の先行研究では８回の計測を行っていた。）また、この方法ではスライドガラス越しに細胞を観察するため、石英ガラス基盤からのラマン散乱が強く混入する。細胞の自家蛍光も含め、分光スベクトルから背景光を合理的に除去してラマン信号を分離するアルゴリズムを考案した。細胞上でのレーザー走査方など種々のパラメータを調製し、現時点では最適化された１細胞分光スペクトルの取得が可能になった。照射強度は15 mW, 照射時間は細胞当たり20秒程度である。
ヒト乳癌細胞由来のMCF-7細胞は成長因子heregulin (HRG)を培養液に添加することによって乳腺細胞様に分化する。HRG添加有無の細胞を5~9日間培養し、その後、多数の１細胞ラマンスペクトルを取得した。これらのスペクトルに対して主成分分析を行い、第1~3主成分の重みによってHRG添加の有無の細胞集団を分離することができた。主成分空間でみた細胞間のスペクトル分布の半値幅は分化、未分化それぞれ状態において、両状態の平均スペクトルの差に比べて充分小さく、個々の細胞の状態を高確率で予測できることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
分光装置の作成と計測法の最適化に時間が掛かり、本格的な分光計測は始まったばかりである。しかし、分化前後の細胞が現在の計測法で区別できるので、今後分化過程を詳細に計測していく。ラマン分光では信号強度の低さから、比較的強い励起光を必要とするため細胞毒性が問題となる。また、背景光除去の方法も問題である。毒性は長波長励起光を用いることで低減されるが、同時にラマン散乱強度も低下する。低次元の主成分で細胞識別が可能ならば、低品位のラマンスペクトルでも分析できる可能性があり、今後の検討課題である。自家蛍光の除去に関しては、蛍光発光とラマン散乱の励起波長依存性の違いを利用して、両者を分離できることが示されており、この点に関しても検討を加える。
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