AID-mediated acute protein degradation system in human mitotic cells

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14721
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 清光 智美 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (10503443)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: AID / RCC1 / ダイニン

Outline of Annual Research Achievements

[目的] 本研究では、オーキシン誘導デグロン(AID)とCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を融合し、哺乳類細胞において任意のタンパク質を急速(30分以内)に分解できる新規実験系の確立を目指している。特に、核内輸送因子として間期で必須機能を担うRan関連遺伝子群を分裂期において急速に分解し、それらの表現型解析を行うことで、哺乳類細胞におけるRan関連因子群の分裂期機能を理解することを第一の目的としている。

[結果] 3種類のRan関連因子(RCC1, RanGAP1, Importin-beta)、およびRan-GTPの下流標的因子 NuMAとダイニン(DHC)の計5種類の遺伝子に加え、新たにダイナクチン(p150)、LIS1、HURPの計8種類のmAIDタグをノックインしたヒト細胞(HCT116)株の樹立に成功し、分裂期中期特異的に急速(30分-1時間)に分解できることも確認できた。またそれらの株において、異なる遺伝子にmCherryやSNAPタグをノックインしたダブル、トリプルノックイン株を樹立し、AID標的因子の分解後にそれぞれの動態を生細胞で観察することに成功した。その結果、RCC1を破壊するとNuMA等の紡錘体局在は変化しないものの、HURPの局在が変化し、紡錘体長の減少がみられた。また一部のダイニンはNuMAとは独立に紡錘体極の維持に機能している可能性が示唆された。さらにヒト不死化細胞株Rpe1細胞を用いてダイニンのデグロン株の樹立にも成功した。

[意義・重要性] これまでヒト細胞において、任意の因子を分裂期中期特異的に分解できる実験系は存在しなかった。また関連因子の動態を同時に可視化することにより表現型解析の分子的理解をより一層進めることが期待できる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

HCT116細胞を用いた実験は順調に進んでいる。特に、ダイニン関連因子の分裂期中期での紡錘体極における極維持機能は不明であったが、樹立した実験系を用いることで一部のダイニンはNuMAとは独立に紡錘体極構造の維持に機能している可能性を示唆することができた。またSNAPタグを用いた可視化がよく機能するため、多重ノックイン細胞による表現型解析をすすめることができた。すでに複数の多重ノックイン細胞を作成することができたため、精力的に解析を行い、論文作成を進めたい。
一方、ヒト不死化細胞株(hTERT-Rpe1細胞)を用いたノックインをすすめたが、HCT116細胞と異なり、ノックイン効率が著しく減少した。そのためトランスフェクションの方法を最適化するなど試行錯誤した結果、ようやくRpe1細胞でもダイニンデグロンのノックイン細胞株を取得することができた。現在ダイニン以外の因子についても同様にすすめている。

Strategy for Future Research Activity

Ran関連因子(RCC1, RanGAP1, Importin-beta)、NuMAおよびダイニン関連因子それぞれについて、デグロン細胞の分裂期表現型を解析し、論文作成に進める。特に、これまでの成果から、NuMA-ダイニンの結合制御機構は、細胞皮層と紡錘体極でも保存されている可能性が示唆された。つまり紡錘体極においてもNuMA、ダイニンは局在し、紡錘体極の収束やその維持に機能していると考えられているが、NuMA-ダイニン結合は同じく紡錘体極に局在するPlk1によって負に制御され、別々に機能する可能性が考えられた(Kiyomitsu and Cheeseman NCB 2012)。ダイニン(DHC)、ダイナクチン(p150)、LIS1、NuMAの分裂期中期分解表現型を軸に、このモデルを実証し論文を作成する。またその一方で、ヒト不死化細胞株(hTERT-Rpe1細胞)やマウスES細胞等での、デグロン細胞株の樹立も進め、細胞種間でも表現型を比較できるようにしたい。

Causes of Carryover

ヒト不死化細胞株(hTERT-Rpe1細胞)を用いたノックイン実験をすすめたが、HCT116細胞と異なり、ノックイン効率が著しく減少した。そのためトランスフェクションの方法を最適化するなど条件検討をする時間が必要となった。現在では、ようやくRpe1細胞でもダイニンデグロンのノックイン細胞株を取得することができたため、次年度以降に実験をすすめたい。また上記の理由により、ES細胞を使ったノックインも開始することができていなかった。すでに共同研究者の鐘巻教授がES細胞を使った実験もすすめているため(Natsume et al., Cell Report 2016)、ES細胞でのノックイン実験も次年度にすすめたい。