2016 Fiscal Year Research-status Report
エンドサイトーシスにおける膜形態変化とタンパク質局在との時空間的同時解析
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16K14722
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
吉村 成弘 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90346106)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | エンドサイトーシス / 高速原子間力顕微鏡 / 表層アクチン / 細胞膜 / 細胞膜受容体 / メカノバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
項目I-1「細胞膜の形状変化と膜裏打ちタンパク質の局在動態との関係解明」：クラスリン依存的エンドサイトーシスに関与すると考えられているタンパク質群（amphiphysin1, Arp2, BIN1, cortactin, GAK, Hip1R, N-WASP, SNX9, clathrin, actin）の局在・集積を、蛍光経時観察する系を構築し、そのいくつかに関しては、高速AFMとの同時観察に成功している。また、機能阻害剤を用いた実験からは、エンドサイトーシスには、formin やArp2/3複合体などのアクチン関連タンパク質の関与が示された。細胞表層におけるアクチンの重合・脱重合のダイナミクスに関して解析したところ、forminやArp2/3には非依存的であった。このことは、クラスリンピット周辺では、周囲の表層アクチンとは異なる制御機構でアクチンの重合が進行し、膜の変形を引き起こしていることを示す。
項目Ⅱ-１「小胞切り離し過程に関与するタンパク質の局在と膜形状変化の関係解明」：小胞の切り離しで主要な役割を果たしているダイナミンに関して、RNA干渉で発現量を低下させた細胞を用いてAFM観察を行った。時間分解能を従来の10秒から2秒に上げたイメージングでは、ピットが2段階の過程を経て閉じる様子が観察された。ダイナミンの発現量低下により、1段階目から2段階目への移行時間に遅れが生じた。このことは、閉口過程前半のステップはダイナミン非依存的に進行すること、および、膜を最終的に括り切るステップでダイナミンの積極的な関与があることを示唆する。
項目Ⅲ「AFM 形状像に対する膜力学モデルの適用法の確立」：連携研究者の安達らと共にモデルについて検討し、膜の連続体モデルを用いてAFMイメージの解析をおこなうことの妥当性などを議論した。現在、解析プログラムの作成に着手している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
項目I-1および項目II-1に関しては、概ね計画通り進行している。来年度も引き続き計画通りに研究を遂行する。その成果の一部は原著論文として投稿済み（1報）および投稿準備中（２報）である。
項目Ⅲに関しては若干の遅れが見られる。膜のモデル選定やAFMの画像解析に予定以上の時間を費やし、これが遅れの原因となったが、すでに解決済みであり、今後は予定通りの遂行が可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度の計画に大きな変更はない。計画通りに遂行する予定である。
項目Ⅰ-２「リガンド依存的膜受容体の取り込み過程におけるタンパク質局在と膜陥入との関係解明」項目I-1 で得た情報を元に、リガンド依存的に細胞内に取り込まれる細胞膜受容体と膜形状との関係を明らかにする。上皮成長因子受容体(EGFR)やトランスフェリン受容体(TfrR)に着目し、リガンド、受容体、裏打ちタンパク質の局在と、膜陥入との時空間的関係を明らかにする。
項目Ⅱ-２「膜小胞切り離し過程における力発生と膜融合機構の解明」：クラスリン被覆ピットが閉じる際の膜変形（隆起）と、その後の膜融合における力発生メカニズムを解明する。項目Ⅱ-1 の結果を受け、膜隆起が脂質二重膜の性質によるものか、ダイナミンによるものか、もしくは、他のタンパク質（アクチンなど）によるものかを明らかにし、膜隆起の力発生に関与するタンパク質を同定する。また、項目Ⅲで確立した力学モデルを用いて、脂質膜そのものの性質が隆起を生み出す仕組み、もしくは各タンパク質が膜に力を及ぼすことによる膜の変形の可能性を検証する。
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