2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞核の構造的特性を理解するためのin vitro再構築系の開発
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16K14727
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
原 裕貴 山口大学, 創成科学研究科, 助教(テニュアトラック) (80767913)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞核 / サイズ / 無細胞再構築系 / 構造的特性 / 細胞生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「核の構造的特性」の理解を本研究の目的とし、1年目は主に2年目以降用いる実験手法の整備と、核内の特徴量に着目した核のサイズの増大速度の制御機構に関する解析を行った。
手法に関しては、アフリカツメガエル卵抽出液による核のin vitro無細胞再構築系を用いた、核の長時間・高頻度でのライブイメージング法を所属機関で常用的に行うための設備を整えた。また、核の構成材料の供給能力を改良するため、用いる生物材料の調整法や細かな実験条件を検討し、従来の無細胞再構築系における核の構造を構築する上での最適な実験条件を探索した。さらに、DNA結合ビーズの作製の予備実験を開始したと共に、DNAビーズとは異なるDNA材料の使用の検討も行った。これら無細胞再構築系の基礎と改良、ライブイメージング法、DNAビーズの作製は、本研究課題において2年目以降使用する手法であり、今後の研究促進が期待できる状態にある。
上記手法の整備・改善の際に、ある実験条件を操作すると、核のサイズが増大する様子が異なることが明らかになった。計画した主たる目的とは異なるが、この核サイズ増大の特徴は、核のサイズ制御に関わる先行研究とは異なる制御機構の存在を示唆するものである。今後、この制御機構を明らかにすることが出来れば、当該領域での研究テーマとしてのインパクトが期待できることに加え、本研究目的である最適な核の構築条件を考察する上での情報を提供することにも繋がりうる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．（当初計画）核のサイズの増加速度の詳細な測定法の確立：おおかた順調に進展した。所属研究室の環境のみでライブイメージングを行う設備は整えられていないものの、所属機関の共通機器の共同利用により十分遂行することが可能となった。設備面に加え、本研究室所属の大学院生が同手法を習得しており、実験を遂行する人的環境の面でも、本研究の遂行に十分な環境を整えることが出来た。
２．（当初計画）既存手法の改善：本研究実施中に報告のあった手法や情報を基に、新たな手法・実験条件の導入を試みた。残念ながら、それら手法が大きな改善策とはならなかったものの、その条件検討の過程から新たな核サイズの増大に関わる制御機構の存在を示唆する実験結果を得た。
３．（当初計画）DNAビーズ核の使用：既知の手法を基にDNA結合ビーズの作製を試み、予備的な実験結果ではあるがDNA結合ビーズの作製に成功した。この手法とは別に、新たにDNA工学のアプローチを応用した異なるDNA材料の使用を検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．DNAビーズ核の操作と条件検討：現状のDNA結合ビーズ作製法を応用し、DNAの状態を操作する実験条件を探索する。そのなかでも、ビーズに結合するDNAの量や質の操作、さらにビーズ自体の物理的特性を操作可能な実験条件の探索に集中する。それと同時に、ビーズ上のDNAが操作できない場合のバックアップとして、生物由来のDNA材料の応用とそのDNA物理特性の操作、さらにビーズ以外の人工DNA材料を用いる手法についても検討する。
２．新規の核サイズの増加の制御機構の解析：1年目に得られたこの特徴の制御機構を解明すべく、さらに解析を進める。核のin vitro無細胞再構築系において、影響を与える核の特性を人為的に操作する実験アプローチを探索し、その依存性を評価する。その後、分子生物学のアプローチを用い、その分子機構の解明を試みる。同時に、この核の特性に摂動を与える手法として、方策１で用いるDNAビーズ・人工DNA材料を応用することも考慮する。
方策１・２のどちらに関しても、研究代表者（原）と共に、本研究の基本実験技術を既に習得した大学院生が主体となり、研究協力体制を整え研究を進める。
３．核のサイズの測定をより円滑に行う環境の整備：現状として、本研究で使用するライブイメージングに必要な顕微鏡システムは、現状所属研究機関が所有する機器を共同利用している。複数人の研究体制でより円滑に本研究を推進する為に、所属研究室で独立しライブイメージングを行うための顕微鏡システムを整備する。
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| Causes of Carryover |
本科学研究費助成事業に申請後、その他の外部研究助成の獲得、並びに大学内部からの援助を得ることができた。それにより、他研究プロジェクトと共通して使用する機器・備品、ならびに試薬・消耗品に関して、補填することが出来た。2年目に予算を持ち越すことで、本研究で用いるライブイメージング法に必要な機器を所属研究室で独立して整備するために、顕微鏡システムの部品の購入費に充て、本研究計画をさらに円滑に推進する研究環境を整える。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本研究で用いる無細胞再構築系を用いて構築した細胞核をライブイメージングするためのプラットフォームである蛍光顕微鏡システムを、所属研究室で独立して整備するため、倒立顕微鏡とその部品の購入費に充てる。これにより、これまで他の研究室の機器、および所属研究機関の共通機器に頼り切っていた蛍光顕微鏡観察を、より効率的に、迅速に行うことが可能となり、本研究計画を遂行する上で大きなメリットなる。
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