2017 Fiscal Year Research-status Report
膜タンパク質小胞体回避モチーフ作用因子の機能解明への挑戦
| Project/Area Number |
16K14730
|
|---|
| Research Institution | University of Hyogo |
|---|
Principal Investigator |
阪口 雅郎 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (30205736)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 細胞オルガネラ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
真核細胞でタンパク質が適切な細胞内オルガネラに配分される機構は、生命活動維持のために必須事項である。大半の膜タンパク質は、合成の初期段階で、膜貫通部の疎水性アミノ酸が連続した配列の情報に従って小胞体膜に移行し、膜内に組み込まれる。一方、ペルオキシソームの膜タンパク質は、このような小胞体への標的化を免れて、その分子の合成が完了してからペルオキシソーム膜に配分される。本研究では、70kDaペルオキシソーム膜タンパク質（PMP70）N末端に存在する小胞体標的化を抑圧する作用（ETS作用）を持つモチーフと化学架橋する因子を精製し、候補の同定に成功した。質量分析で同定された候補因子を大腸菌にて発現し、組み換え体を使って、ETS-配列への結合を確認し、候補Aではモチーフの点変異（S5A）に対しては結合が大きく低下するなどの、配列特異性が確認された。候補Aにはアイソフォーム１，２が存在していた。ノックダウン実験によってA1、A2ともにETS作用が大きく低下することが認められた。さらにノックダウン抵抗性のcDNAを作成しレスキュー実験を行ったところ、A1、A2いずれもETS作用を回復することが確認され、因子AがETS因子であることが確定した。HeLa細胞でA1、A2の存在量を、両方を認識する抗体で見積もったところ、A1が圧倒的に多くA2はほとんど発現していないことがわかった。A因子の立体構造情報をもとに、基質結合部位、ポリペプチド鎖結合部位、転移反応触媒残基などの特定のアミノ酸残基に変異を導入し、それらによるレスキュー作用（ETS作用の回復）を解析する予定である。すでにそれらの設計が完了し、いくつかについては、DNAの構築に着手している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PMP70のN-末端にETS作用のあるモチーフを発見したのみならず、それに作用する因子を同定し、特異抗体の入手、そのノックアウトによるETS機能の不全の確認、レスキューによるETSの回復確認、などA因子が当該因子であることが確定できたことは特筆に値する。ETS作用に必要な配列の解析は常法通りのDNA操作と細胞生物学の実験手法でなしうるが、それに結合する因子の同定には、その結合活性の定量的アッセイ系の設定、生化学的な分画の実行など、きわめて困難な作業が必要であるからである。これで機能的な確認は予定以上に完了したと考える。総合して、(2)おおむね順調に進展していると、判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
ノックダウン実験系で、作用の抑制、レスキューで機能の相補が確認できたので、おおむね本研究課題の目的は達せられたのであるが、期間延長によって、この実験系を用いてA因子の各種変異体を作成し、構造と機能（ETS活性）との相関を明らかにするまでを実施したい。さらに、組み換え型A因子を用いて、ヒト無細胞タンパク質合成系でのETS作用の再構成に挑戦する。これらに成功すれば、その作用の素過程、また他の因子との関連が明らかになる。以上の知見を総合することで、小胞体標的化抑制という新しい概念を確立したい。
|
| Causes of Carryover |
膜タンパク質小胞体回避モチーフ作用因子の機能解明のために、nmt1ノックダウン系を整備し、ノックダウン抵抗性nmt1遺伝子による回復確認実験を行った。nmt1が追求してきた因子であることがほぼ確定的となった。おおむね目的は達せられたのであるが、さらにその小胞体標的化抑制の機能とnmt1酵素活性との関連を追及し、レベルの高い研究論文に仕上げる段階に到達したため、延長したい。
|
