2018 Fiscal Year Annual Research Report
Challenge to elucidation of the function of ER-targeting suppressing factor for membrane protein
| Project/Area Number |
16K14730
|
|---|
| Research Institution | University of Hyogo |
|---|
Principal Investigator |
阪口 雅郎 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (30205736)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 膜タンパク質 / 細胞小器官 / ミリスチル化 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
真核細胞でタンパク質が適切な細胞内オルガネラに配分される機構は、生命活動維持のために必須事項である。大半の膜タンパク質は、合成の初期段階で、膜貫通部の疎水性アミノ酸が連続した配列の情報に従って小胞体膜に移行し、ポリペプチド鎖の伸長に伴って膜内に組み込まれる。一方、ペルオキシソームの一群の膜タンパク質は、このような小胞体への標的化を免れて、その分子の合成が完了してからペルオキシソーム膜に配分される。本研究では、70kDaペルオキシソーム膜タンパク質（PMP70）N末端に存在する小胞体標的化を抑圧する作用（ETS作用）を持つモチーフと化学架橋する因子を精製し、候補タンパク質を同定した。質量分析で同定された候補因子を大腸菌にて発現し、組み換え体を使ってETS-配列への結合を確認し、N-末端ミリスチル化酵素（Nmt1）であることを明らかにした。Nmtにはアイソフォーム1,2が存在することが知られているが、ノックダウンによって両者ともにETS作用が低下することを確認した。さらにノックダウン抵抗性のcDNAを作成し、レスキュー実験によって、Nmt1、Nmt2いずれもETS作用を示すことが確認された。また、HeLa細胞ではNmt1が圧倒的に多く、Nmt2はほとんど発現していないことがわかった。Nmt1の立体構造情報をもとに、ミリスチルCoA結合部位、基質ペプチド鎖結合部位、転移反応触媒残基などの特定のアミノ酸残基に変異を導入し、それらによるETS作用のレスキューを解析し、ペプチド結合部位の変位によってETS作用が低下することを明らかにした。以上、ETSモチーフの発見から、結合因子の同定、機能確認まで達成でき、本萌芽的研究で目的とした事項は達せられたと考えている。
|
