形態形成における膜電位の機能－電気が作る骨のかたち

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14736
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 荒巻 敏寛 大阪大学, 生命機能研究科, 特任研究員(常勤) (30525340)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 骨形成 / 電気シグナル / 光遺伝学

Outline of Annual Research Achievements

鰭が著しく伸長するゼブラフィッシュanother-long-fin変異体では、runx2遺伝子陽性の骨芽細胞の膜電位が過分極することにより鰭条骨の伸長が起こると推測されている。この仮説を検証するために、当年度ではrunx2遺伝子プロモーター制御下にチャネルロドプシン（ChR2）を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作成し、骨芽細胞の膜電位を人為的に脱分極させる実験を試みた。様々なChR2改変体を導入したトランスジェニック体を作成し、青色光を照射する実験を行ったところ、チャネル開口時間が長く、かつコンダクタンスの大きいChR2改変体を導入したトランスジェニック体において鰭条骨の短縮などの形態変化が観察された。この結果は上記の仮説を支持するものである。
生体内における電気シグナルの働きを理解するためには、遺伝子導入などによる機能解析実験に加えて、内在するシグナルの検出も重要である。しかしながら、研究が進んでいる神経細胞や筋細胞などと比べると、今回標的とする骨芽細胞に生じている膜電位変化は小さく、また緩慢なものであると推測される。このことを考慮し、本研究では検出感度の高さを最優先としてE-SARE（Synaptic Activity Responsive Element）プロモーターを用いたレポーター遺伝子発現による可視化を試みた。当年度作成した、E-SAREプロモーター制御下にEGFPを発現するレポーターフィッシュでは、鰭条骨に沿ったEGFPの発現が観察されており、鰭条骨の形成に電気シグナルが関与していることを強く示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では膜電位操作による骨の形態制御を目標として、骨芽細胞への光遺伝学技術の導入を試みている。計画時に予測していた通り、発生学的な時間スケールに合わせてチャネル開口時間の長い、かつコンダクタンスの大きいChR2改変体を用いることにより、光照射依存的に鰭条骨の形態を変化させることに成功した。
また上記のような人為的操作に加え、内在性の電気シグナルの検出も試みている。当初は神経活動の検出に一般的に用いられるGCaMPやmermaidのようなタンパク質プローブの使用を計画していた。しかしながら、これらのプローブは時空間的解像度が高い一方で、検出感度が比較的低い。そのため神経活動のような進行の早い現象（数ミリ秒－数秒）を観察するためには適しているが、比較的進行の遅い発生学的な現象（数時間－数日）における変化を検出するためには不向きであると考えた。そこで計画を変更し、時空間的解像度は低いものの検出感度に優れた、活動電位応答性のプロモーター配列（E-SARE）によるレポーター遺伝子発現を用いた可視化を試みた。その結果、予想通り鰭条骨における電気的活動を検出することに成功した。

Strategy for Future Research Activity

当年度に作成したChR2トランスジェニックフィッシュでは、光照射時に骨芽細胞の脱分極を引き起こす。一方で近年、開口時に逆に過分極を引き起こすChR2改変体、iChloCが開発された。本研究ではiChloCにについても同様にトランスジェニックフィッシュを作成する予定である。ChR2による脱分極誘導、iChloCによる過分極誘導のそれぞれについて膜電位の変動が鰭条骨の形態形成に与える影響を観察し、更に相反する条件での比較を行うことで骨形成における電気シグナルの機能をより明確に明らかにできると考えている。
また、E-SAREプロモーターを用いたレポーターフィッシュを作成したことで、神経系のみならず様々な細胞における電気的活動を生体内でリアルタイムに可視化することができるようになった。本研究では特に骨形成や骨修復時における電気シグナルを重点的に観察し、その時空間的な変動やパターンから新たな知見が見出されることを期待している。

Causes of Carryover

計画段階では、光照射を行いながらゼブラフィッシュを飼育する比較的大規模なシステムを構築する予定であった。しかしながら、当年度の実施内容は実験条件の検討が主であり、個々の実験スケールを小さく抑えることで既存のシステムで十分に対応することができた。
また、当年度参加を予定していた第４９回日本発生生物学会（熊本）が災害のため中止となったことで旅費の支出が抑えられた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当年度の実験結果を元に、以降はスケールを拡大して実験を行う予定である。そのためのLED照射装置、飼育用インキュベーターの増設を次年度に行う。