2016 Fiscal Year Research-status Report

細胞が組織に占める位置情報を保持したままエピゲノム情報を可視化する方法の開発

Research Project

Project/Area Number	16K14745
Research Institution	National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Principal Investigator	佐々木保典国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (30312242)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords	エピゲノム情報 / 遺伝子発現制御
Outline of Annual Research Achievements	①クロマチン修飾あるいはDNA結合因子が結合したゲノム領域の識別と③Coincidence detection NEAT1遺伝子座上における、nascentNEAT1 RNAとRNA結合タンパク質NONOとの相互作用が知られている。まず、NEAT1 RNAとNONOとの相互作用について本法のプロトタイプを適用して、検出に成功した。これは、RNA分子とタンパク質分子間の相互作用は多分子対多分子であり検出が容易と考えたからである。次に難易度を高め、NEAT1遺伝子座（HeLa細胞で4か所）とNONOタンパク質間の相互作用検出を試みた。NONOはNEAT1遺伝子座に直接結合していないが、NEAT1遺伝子座上に、NONOを主な構成因子とする核内構造体パラスペックルが形成される。そこで、NEAT1遺伝子座とNONOとを同時に抗体で認識すると、これら二つの抗体間距離が50nm以下になり、近接している抗体ペアのみを検出できると考えた。NEAT1遺伝子の転写開始点上流を約500bpのプローブで認識し、そのプローブを二次抗体（マウス）で認識した。一方、NONOは抗NONO抗体（ウサギ）と抗ウサギ二次抗体で認識した。これら二種の二次抗体について、近傍にあるペアのみのcoincidence detectionに成功し、NEAT1遺伝子座上にNONOのシグナルをマップできた。 ②標的ゲノム領域の特定本法をライブイメージングに適用することを念頭に、CRISPR/Cas9システムにより遺伝子発現制御領域を特定することを目指した。予備実験として、ある遺伝子の転写開始点上流域、特にプロモーターやエンハンサーを標的としたガイドRNAとCas9を異所発現し、その領域を可視化した。しかし、制御領域にCas9が結合すると下流の遺伝子発現に影響を及ぼすため、この方法は必ずしも適当ではないことがわかってきた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ＜Coincidence detection条件をDNA-結合タンパク質相互作用検出に最適化する＞当初の計画は、NEAT1遺伝子座＝NONOタンパク質相互作用と共に、ヒト細胞におけるX染色体不活性化の系でXISTプロモーター領域とH3K4me3など、特定のDNA-タンパク質相互作用を核内にマップする予定であったが、後者の実験が完了しなかった。＜標的ゲノム領域を限定する方法（プローブ）の検討＞ CRISPR/Cas9システムを用いてゲノムの特定領域を可視化する方法は、すでに確立された方法論を導入したので、そこに障害はなかったが問題はより本質的なところにあった。構造遺伝子の上流にCas9タンパク質が結合すると、下流遺伝子発現に影響を及ぼすことがわかってきた。この問題をクリアする新しいアイデアが浮かぶまで、Cas9システムを使った標的ゲノム認識は中断する。
Strategy for Future Research Activity	ライブイメージングへの応用は今後の課題として、まずは固定組織について本法を確立することに専念する。すなわち標的ゲノム領域を特定する手段として、CRISPR/Cas9システムは一旦置いて、オリゴプローブ、特にPLAプローブを使うプロトコルに集中する。特定のゲノム領域といったときに、クロマチン一個を基準に考えると150ヌクレオチド前後を単位としたい。するとやはり本法に用いるプローブはオリゴプローブが最適である。今年度はエンハンサーRNAを使って標的ゲノム領域を可視化する方法に未着手だったので、この方法も試みる。ただしこの方法は、現在注目している遺伝子の制御領域に適当なエンハンサーRNAが発現しているかに依存するので一般的ではなく、まずはそのようなエンハンサーRNAの有無を検定する。
Causes of Carryover	当初の計画は、NEAT1遺伝子座＝NONOタンパク質相互作用と共に、ヒト細胞におけるX染色体不活性化の系でXISTプロモーター領域とH3K4me3など、特定のDNA-タンパク質相互作用を核内にマップする予定であったが、後者の実験が完了しなかった。また、標的ゲノムを限定する方法の検討で当初三つの計画があったが、LNAプローブの検討とeRNAの検討がほとんどできなかった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	以下の二つの実験に使用する。 ①標的ゲノムを限定する方法の検討において、LNAプローブとeRNAの二つを検討する実験。②ヒト細胞におけるX染色体不活性化の系でXISTプロモーター領域とH3K4me3など、特定のDNA-タンパク質相互作用を核内にマップする実験。