2016 Fiscal Year Research-status Report
脊索動物ホヤの卵胞成長におけるカテプシンファミリー遺伝子非コードRNAの役割
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16K14772
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| Research Institution | Suntory Foundation for Life Sciences |
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Principal Investigator |
酒井 翼 公益財団法人サントリー生命科学財団, 生物有機科学研究所・統合生体分子機能研究部, 研究員 (40414122)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | antisense RNA / follicle / ascidian / cathepsins |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カタユウレイボヤ卵胞で発現する酸性プロテアーゼcathepsin関連antisenseRNA(asRNA)の同定にあたり、本研究ではRNAビーズ法と次世代シーケンサーを組み合わせたRNA-seq解析を計画している。しかし、本年度は、まずホヤ卵胞におけるcathepsin asRNAの存在を確定すること、そして各実験要素技術の精度を確認することに重点を置いた。
まず、カタユウレイボヤESTデータベース上に発現が示されるcathepsin b (Ci-ctsb)のasRNAに目をつけ、配列データに基いてプライマーを設計し、PCRで卵胞cDNAからクローニングすることが出来た。これにより、ホヤ卵胞におけるcathepsin関連asRNAの発現が示された。次に、RNAビーズ法を用いて卵胞からカテプシン関連asRNAのクローニングを行った。約500bpからなるCi-ctsdのビオチン標識化senseRNAを合成し、カタユウレイボヤ卵胞のRNAとハイブリダイズ後、アビジンビーズに吸着させてカラムで精製した。このRNAビーズ法で２つのasRNAが同定され、それぞれCi-ctsd、Ci-ctsbと類似した配列を有する、ESTデータベースに未登録のasRNAのクローニングに成功した。
以上の実験により、カテプシン関連asRNAのホヤ卵胞における発現が確実であること、RNAビーズ法が有効であることが証明された。来年度は、これらのasRNAを指標として確信を持ってRNA-seq解析を実施することが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
カタユウレイボヤ卵胞cDNAからcathepsin b (Ci-ctsb)のantisenseRNA (asRNA)をPCRでクローニングし、続いて、Ci-ctsdのビオチン標識化senseRNAを用いたRNAビーズ法でホヤ卵胞から複数のカテプシン関連asRNAのクローニングに成功した。同定された２つのasRNAはそれぞれCi-ctsd、Ci-ctsbと類似した配列を持ち、カタユウレイボヤESTデータベースに未登録のasRNAであった。これらの実験により、カテプシン関連asRNAのホヤ卵胞における発現が確実であること、RNAビーズ法が有効であることが証明された。また、ふるい法による精度の高い卵胞ステージ別分離を習得したことで、良質な卵胞サンプリングが出来るようになった。
本年度はビーズ精製したasRNAに対してプライマーによって選択（増幅）されたcDNAだけがシークエンスされたが、来年度のRNA-seq解析ではRNAビーズに引っかかる全てのRNAが読み取られるため、慎重にアーティファクトを排除する必要がある。そのためのコントロールとして、どのようなRNAプローブをRNAビーズ法に用いるかが重要となる。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、ホヤ卵胞で発現するcathepsinファミリー遺伝子のncRNA及びasRNAをRNAビーズ法とRNA-seq解析の組み合わせで同定する。上記の問題への対策として、RNAビーズ法におけるネガティブコントロールとしてベータアクチン等のハウスキーピング遺伝子のRNAをRNAプローブとして用いると共に、Ci-ctsb, d, h, lの各senseRNAプローブにハイブリダイズするasRNAを比較することで、全ての区に検出されるものはアーティファクトとして排除する。
また、Ci-ctsd及びCi-ctshのasRNAがコードすると考えられるペプチドの発現と動態を明らかにするため、それらの特異的抗体を作製してホヤ卵胞成長における発現解析を実施する。
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| Causes of Carryover |
消耗品費としては遺伝子産物の解析のため高価な試薬が必要とされ、特にRNAの配列解読のため次世代シークエンサーを用いたRNA-Seqを実施する。それ以外には、特異的抗体の作製費用と共に定量PCR試薬、ISH 用のプローブ作製用試薬、抗体実験の検出試薬、DNAプライマーなどを分子生物学実験試薬として計上した。
そして、養殖したカタユウレイボヤをNBRPから入手する費用、水産試験場でのホヤのサンプリングための宿泊費・交通費、研究成果の発表にあたり学会やでの宿泊費・交通費・参加費を計上する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
カタユウレイボヤのカテプシン遺伝子発現ベクターを用いてビオチン標識sense RNAを作製し、アビジンとのアフィニティーにより結合させてRNAプローブビーズを調製する。ホヤ卵巣の各ステージの卵胞は積層網ふるいを用いてホヤ卵巣から直径によって各成長ステージの卵胞を人工海水中で分別する。その中からCTSファミリー遺伝子のRNA発現が検出された卵黄形成期のStage II卵胞の破砕溶液を調製し、RNAプローブビーズと結合するantisenseRNAの精製を行う。そして次世代シーケンサーMi-seq（Illumina社）によるRNAseq解析でcts-b、 -d、 -lの各sense鎖と結合するncRNAをそれぞれ同定する。
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