2016 Fiscal Year Research-status Report
ロドプシン類の発色団変換を利用した新規光遺伝学の確立
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16K14778
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
寺北 明久 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (30212062)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 光受容タンパク質 / オプシン / 光遺伝学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
A2結合型オプシンはその波長感受性がA1結合型オプシンと比較して、長波長シフトすることが知られている。その性質を光遺伝学に応用するために、培養細胞系を用いて、ロドプシン遺伝子とA1/A2レチナール変換酵素を同時に発現させ、波長感受性の解析を、以下の通りに行った。
・光遺伝学的利用を想定し、過剰のレチナールを加えない条件で、培養細胞でオプシンを発現させ、レチナールを加えることなく、光反応性を解析した。具体的には、非視覚型オプシン（GiまたはGs型タンパク質を介してcAMP濃度の光依存的変動をもたらす）とゼブラフィッシュで同定されたA1/A2レチナール変換酵素（Cyp27c1）を同時に培養細胞で発現させた。そして、レチナールの添加なしに、既に報告しているcAMP感受性の発酵タンパク質を用いる方法により（Sugihara et al., 2016）、培養細胞のさまざまな波長における光応答を細胞内cAMPの変化量により評価した。それを基に、オプシンの波長感受性から吸収スペクトルを推定し、A2レチナールを結合しているロドプシン類の割合を、解析した。そのために、A1レチナールを結合したオプシンのスペクトルとA2レチナールを結合しているオプシンのスペクトルが必要であるので、あらかじめA2レチナールを加えて人工的にオプシン色素を生成し、スペクトル測定を行った。そのA1スペクトルとA2スペクトルを用いて解析した結果、オプシンは確かに、酵素により生成されたA2レチナールを結合していることが示唆され、ゼブラフィッシュのA1/A2レチナール変換酵素が有効であると考えられた。
・ポリシストロニックにロドプシン遺伝子とA1/A2レチナール変換酵素遺伝子を発現させる遺伝子コンストラクトを１種類作製し、培養細胞での検討を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通りに、レチナールA1からA2へと酵素的な変換に成功し、非視覚型のオプシンが酵素的に生成したA2を結合し、その波長感受性が赤色シフトすることが確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今 今年度に引き続き、培養細胞系を用いて、ロドプシン遺伝子とA1/A2レチナール変換酵素を同時に発現し、波長感受性の解析を行う。特に、培養細胞にロドプシン遺伝子とA1/A2レチナール変換酵素を1つのプロモーターによりポリシストロニックに発現させ、オプシンがA2レチナールを結合する割合が高くなるような系を構築する。現在最も長波長に吸収極大が存在する微生物型（ReaChR）または動物型（ナミアゲハ赤視物質）が効率よくA2レチナールを結合するコンストラクトの作製を試みる。
また、ポリシストロニックにロドプシン遺伝子とA1/A2レチナール変換酵素遺伝子を発現させる遺伝子コンストラクトを、ゼブラフィシュ胚の運動を制御する神経細胞やセンチュウの運動神経に発現させ、生体の窓の波長域付近の光により逃避運動が制御されるかの解析も試みる。
さらに、他の動物由来のA1/A2レチナール変換酵素を用いて、効率の良さをゼブラフィッシュのA1/A2レチナール変換酵素と比較することも試みる。
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| Causes of Carryover |
多様なA1/A2レチナール変換酵素を、予備的な実験系において比較検討する当初計画であったが、ゼブラフィッシュの酵素の活性が予想よりも高かったために、実際の光遺伝学的利用を先に進め、多様な酵素の有用性の比較は光遺伝学的な利用過程において実施することとしたため、次年度使用学が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
多様なA1/A2レチナール変換酵素の活性の比較検討を光遺伝学的な利用過程において実施し、最終的に最も良いA1/A2レチナール変換酵素系を構築する。
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