修飾特異的な抗体を用いないヒストン翻訳後修飾の解析系の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14785
• Research Institution: Waseda University
• Principal Investigator: 立和名 博昭 早稲田大学, 理工学術院, 次席研究員(研究院講師) (70546382)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ヒストン / クロマチン

Outline of Annual Research Achievements

真核生物のゲノムDNAは、クロマチン構造をとり細胞核内に収納されている。クロマチンは、その構造を可逆的に変化させることで遺伝子のオン・オフを制御している。クロマチンの構造変化を可能にしている因子の一つとして、ヒストンタンパク質がある。４種類のヒストンタンパク質（H2A、H2B、H3およびH4）は、各2分子からなる八量体を形成し、そこにDNAが1.5回転巻き付いたクロマチンの基本単位となるヌクレオソーム構造を形成している。そのため、クロマチンの構造変化はヌクレオソーム単位で起こる変化の総和として起こる。ヌクレオソームに起こる主な変化は、ヒストンの翻訳後修飾である。翻訳後修飾は特異的な抗体を用いて検出することが一般的であるが、抗体の作製に多くの時間と労力が費やされてきた。本研究は、この特異的な抗体を用いない解析系の確立を目的として行っている。本年度は、リコンビナントタンパク質としてエピトープタグ融合のヒストンの発現および精製系の確立を行った。これまでに、ヒストン亜種を含む７種類のヒストンをエピトープタグ（HA、FLAG、V5タグ）融合タンパク質として精製することに成功した。そして、これらのヒストンタンパク質を含む機能的な複合体（H2A-H2BおよびH3-H4複合体）を試験管内において再構成する系も確立した。また、これらの複合体を界面活性剤で処理した透過性細胞に加え、免疫染色法により観察したところ、クロマチンに取り込まれており、そのダイナミクスも細胞内で観察されていたものと同様であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

これまでに、主要型ヒストンおよびヒストンバリアントを解析できる系の確立を行うことができた。さらに、透過性細胞に取り込ませたヒストンをクロマチン免疫沈降法（ChIP）にて回収する系の確立に成功した。これにより、様々な条件下においてヒストンの動態を解析することができる様になった。このため、当初の研究目的以上の成果が期待できるため。

Strategy for Future Research Activity

リコンビナントタンパク質として精製を行ったエピトープ融合ヒストンに化学修飾を試験管内において導入を行う。これには、システイン残基のアルキル化によるリジン残基のメチル化ミミックを用いる。または、インテインによる合成ペプチドのライゲーション法を用いる。これらの方法により化学修飾を導入したヒストンの動態を、透過性細胞を用いた解析により行う。また、細胞抽出液を用いて、これらの修飾ヒストンに特異的に結合している因子の解析も行う。