2017 Fiscal Year Annual Research Report
Resurrection of primordial RNA polymerase by in vitro evolution experiments
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16K14793
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
田上 俊輔 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, ユニットリーダー (40586939)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 分子進化 / 構造生物学 / RNAポリメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，Last universal common ancestor（LUCA）以前の生命進化の経路を明らかにするために，LUCA以前から生命の遺伝子発現制御において重要な役割を果たしてきであろうRNAポリメラーゼを対象にした分子進化実験を行った. 現存生物のRNAポリメラーゼは分子量約30万にもなる巨大なタンパク質複合体であるが，原始生命においてはRNAポリメラーゼもより単純なタンパク質として誕生したと考えられる．そこで本研究では，まず現存生物のRNAポリメラーゼから本質的な活性に不要なドメインを切り詰めて原始RNAポリメラーゼを再構築することを試みた．しかし，このような巨大なサブユニットの酵素をエンジニアリングすることは遺伝子操作やタンパク質発現の面で大きな困難を伴った. そこで，方針を変更し，まずは現存のRNAポリメラーゼの活性中心ドメイン（約100アミノ酸）のみを切り出した 原始タンパク質を再現することにした．RNAポリメラーゼのような巨大なタンパク質では，その活性中心ドメインはその他のドメインに取り囲まれている．その為，活性中心ドメインのみを切り出してくると，周りのドメインとの相互作用に使われている疎水性残基が表面に露出してしまうことになる．結果，活性中心ドメインのみ切り出してきたタンパク質の可溶化率は非常に低かった．しかし，我々は祖先配列予測や保存配列に基づく人 工的なタンパク質配列のデザイン，さらに立体構造情報に基づく変異導入を駆使することによって，可溶性の高い活性中心ドメインを 再現することに成功した. さらに短いペプチドを用いてRNAポリメラーゼの活性部位と同様のβシートの形成も行った．
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