高効率物質生産植物体の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14833
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 松尾 幸毅 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (10358012)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: RNAサイレンシング / 物質生産 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

２０１６年度は、まず遺伝子ノックアウトのためのコンストラクトの設計を行った。本研究のモデル植物体であるＮｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ由来する遺伝子サイレンシング関連遺伝子について、各種ソフトウェアによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおける標的配列を検索し、ガイドＲＮＡ発現のためのコンストラクトを複数設計した。
次に、Ｃａｓ９遺伝子発現のためのベクターの構築を行った。Ｃａｓ９遺伝子を、植物遺伝子組換えのためのバイナリーベクターであるｐＢＥ２１１３へと組み込んだ。本ベクターを用いて更にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４株の形質転換を行った。本アグロバクテリウムを用いて、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける一過性発現試験をアグロインフィルトレーション法により行った。ウエスタンブロット解析の結果、植物体内でのCas9タンパク質の発現が確認された。更に、Cas9タンパク質発現用ベクターの一部を制限酵素により切断後、切断個所にガイドRNA発現カセットをクローニングした。本ベクターによりＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株の形質転換を行い、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける一過性発現試験をアグロインフィルトレーション法により行った。植物体内でのＣａｓ９タンパク質の発現が、先ほどと同様にウエスタンブロット解析により確認された。今後は標的DNAへの変異導入に関し検討を加える予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究室移転があったため、移転前後において研究活動が滞った。

Strategy for Future Research Activity

今後は作成したベクターを用いて、順次N. benthamianaの形質転換を実施し、得られた再分化個体について遺伝子改変状況を解析する予定である。

Causes of Carryover

研究室の移転により研究活動が移転前後で滞り、当初の研究計画よりやや遅れているため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

消耗品等の購入に充当する予定である。