2017 Fiscal Year Research-status Report

下流制御因子の同定によるノンクライマクテリック型果実の成熟・老化制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	16K14853
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	中野龍平岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (70294444)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	NAC転写因子 / EIL遺伝子 / 果実成熟 / 老化 / ノンクライマクテリック型
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、成熟や老化にエチレンが関与せず、その制御機構に不明な点の多いノンクライマクテリック型果実に関して、EIN3/EILsおよびその下流において働くmiRNA164やNAC転写因子の関与に注目し、以下の結果が得られている。１）EIN3/EILs抑制RNAi個体の育成と解析： EIN3/EILsの保存領域を利用したRNAi個体について、後代を育成したところサイレンシングが広範となり、Fv-EIL1に加えてFv-EIL2が抑制される個体が得られたが、果実成熟や老化へのサイレンシングの影響はなかった。一方では、後述するRNA-seq解析により、Fv-EIL1、Fv-EIL2に加えてFv-EIL3の発現量が多かった。そこで、Fv-EIL3を抑制するRNAiやVIGSコンストラクトを作成した。２）NAC転写因子とmiRNA164の成熟制御への関与の解析：miRNA164のターゲット配列を持ち、成熟に伴って発現量が100倍に増加するNAC-SFのRNAi個体の作成を試み、100系統以上の組換え体のカルスが得られ、その内１系統ではシュートが再分化まで到達した。VIGS法に関して、種子に感染させ高頻度でVIGSを誘導する手法のイチゴ野生種F. vescaでの開発を試み、手法確認のためのPDS遺伝子や EIL3、NAC-SFなどを導入したTRV2コンストラクトを作成した。３）イチゴ成熟時の遺伝子発現の網羅的解析：RNA-seqにより、イチゴの果実成熟に伴う、遺伝子発現量変化の網羅的解析を進め、成熟に伴って増大する遺伝子群を把握した。NAC-SFに加えて、トマト成熟への関与するSl-NAC1および4のイチゴのホモログが老化時に発現が増加することが明らかとなり、新たな候補NAC遺伝子を発見している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、以下の３項目に関して、研究を実施し、以下のように概ね順調に進展している、１) EIN3/EILs抑制RNAi個体の育成と解析では、EIN3/EILsの保存領域として、Fv-EIL1由来の配列をhair-pin構造に利用したRNAi個体において、後代を育成し、Fv-EIL1に加えてFv-EIL2が抑制された個体が得られた。この個体では、成熟には影響はみられておらず、他のホモログの成熟制御への関与の可能性が示された。RNA-seq解析により、Fv-EIL1、Fv-EIL2に加えてFv-EIL3の発現量が多いことから、成熟制御の候補因子となってきた。これは想定の範疇であり、Fv-EIL3のみ抑制するRNAiやVIGSの準備も進めており、予定通りに研究は進んでいる。２) NAC転写因子の成熟制御への関与については、miRNA164のターゲット配列を持ち、成熟に伴い発現量が増大するNAC-SFについて、RNAi個体の作成を進め100系統近くの組換え体のカルスが得られている。これらより個体が再分化され、RNAi個体の成熟様相や成熟関連遺伝子の発現解析により、NAC-SFの成熟への関与が明らかになると期待される。３）RNA-seqによる網羅的解析により、前述のFv-EIL3の重要性や、NAC-SFの成熟時の発現増大などが確認されのに加え、老化に関与する他のNAC候補遺伝子の発見に至っている。また、種子に感染させることで高頻度にVIGSを誘導する手法のイチゴ２倍体野生種での開発を進めており、RNAi個体の作成に加えて、VIGSによる、より多くの遺伝子の機能解析を実施する体制が整っている。
Strategy for Future Research Activity	ノンクライマクテリック型果実であるイチゴの成熟や老化への、EIN3/EILsおよびその下流において働くmiRNA164とNAC転写因子の関与の解明を目指し、以下の研究を実施する。 1)RNAi個体の育成と解析：これまでに作成したEIN3/EILsの保存領域をhair-pin構造に利用したRNAi個体について、サイレンシングがより広範となることが期待し、さらに後代を育成し、その果実成熟、老化を調査する。また、新たにFv-EIL3の配列を利用したRNAi個体を育成する。また、 NAC-SFのRNAi個体に関しては、カルスからの再分化を促し、個体育成、その成熟や老化様相を調査する。２）VIGSによる機能解析：種子に感染させることで高頻度にVIGSを誘導する手法をイチゴ２倍体野生種F. vescaにおいて開発し、Fv-EIL3、NAC-SFに加えてmiRNA164や新たに候補となったトマトの成熟関連のNAC遺伝子のホモログなどに関して、機能解析を実施する。３）RNA-seq解析：明確な表現型を示すRNAi個体が得られた場合には、その個体のRNA-seq解析を実施し、NAC転写因子やEIL転写因子の下流において制御されている成熟関連遺伝子群を網羅的に解析する。また、成熟に伴うmicroRNAの発現変化に関しても、次世代シークエンス解析あるいはデータベース上の情報のin silico解析により、調査する。
Causes of Carryover	EIN3/EILs抑制RNAi個体において、成熟および老化の抑制が観察された場合に、香り成分の分析や成熟関連遺伝子の網羅的解析を予定していたが、本年度の段階では、成熟や老化への明確な表現型への影響は観察されなかったために、これらの解析を次年度以降に実施することに変更し、Fv-EIL3や NAC-SFなど、新たなRNAi個体の作成、および、高頻度なVIGS法の確率に注力したため、次年度使用額が生じた。 EIN3/EILs抑制RNAi個体以外に、Fv-EIL3や NAC-SFなど、新たなRNAi個体の作成に取り組んでいる。また、これまでの、RNA-seq解析の実施により、新たに候補となるNAC遺伝子が２つ見つかっている。さらに、高頻度にVIGSを誘導できる手法をイチゴ２倍体野生種F. vescaに適用することで、より多くの遺伝子の機能解析が可能となる体制を整えている。これら計画当初よりも多くの候補遺伝子の機能解析の実施に使用するとともに、これらのサイレンシング個体において、その下流において制御されている遺伝子群の解析の実施に使用する計画である。この実施およびin silicoを含めた成熟・老化時のmicroRNAの解析のために、H30年度より、新たに分担者の追加している。