Comprehensive analysis of full length cDNA and alternative splicing for the genes related to fruit development and ripening

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K14854
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 牛島 幸一郎 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (20379720)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 門田 有希 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (30646089) ; 赤木 剛士 京都大学, 農学研究科, 助教 (50611919)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: Iso-seq

Outline of Annual Research Achievements

メロン果実において発現している完全長cDNA配列の単離を行った．ライブラリー作成と解読方法についてについて検討を行った．
メロン果実からtotal RNAからClontech社のSMARTer kit，LexogenのTeloprime kit，さらにOligo capping法を利用したライブラリーを作成した．得られたライブラリーをSequelで解読し，バーコードごとに配列を解析した．その結果，SMARTer法では25,915（2,020bp），Teloprimeでは26,666（1,863bp）, Oligocapping法では2,082（1340bp）のIsoformaが得られた．STARを用いて公開されているメロンゲノムにmappingしたところ，90%の配列がmappingされていた．さらに転写開始点，転写終結点をメロンゲノムのアノテーションと比較した．その結果，アノテーションのTSSよりの上流側にTSSがあるのはそれぞれ，26%，32%,19%のIsoformであり，Teloprimeが最も良かった．
上記と同じライブラリーを，Nanoporeを利用して解読した．PacBioのCCSのように解読精度の向上を図るのは困難である．そのため得られた生のリードをmappingしても5%以下のリードしかマップされない．そこで，de novo assemblerであるcanuの補正機能を利用して配列を補正してmappingした．その結果，map率が70%以上に向上した．しかし，多くのリードが部分配列であり，完全長配列の取得にはスクリプトの改善が必要であると考えられた．mappingのスプライシング・ジャンクションについては精度高いと推測されるので，intron情報の取得には十分なレベルであると考えられた．