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2016 Fiscal Year Research-status Report

アーキア膜脂質の生産によるバクテリア細胞膜強化の試み

Research Project

Project/Area Number 16K14882
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

邊見 久  名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (60302189)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2018-03-31
Keywordsアーキア / 膜脂質 / バクテリア / 細胞膜 / 酵素
Outline of Annual Research Achievements

アーキア膜脂質の存在が同脂質を生産する大腸菌の細胞膜に与える影響を調べることを目的とし、まずは生産量の向上を図った。酵母のメバロン酸経路の遺伝子をプラスミドによりアーキア膜脂質生産大腸菌に導入し、さらに同経路の中間体を与えるメバロノラクトンを培地に添加することでアーキア膜脂質の生産量を向上させることに成功した。しかし、達成された生産量は膜の性質を調べるにはまだ不十分なレベルであり、さらに高生産状態は不安定で維持することが難しかった。そこで、その改善を目的として複数種のアーキアおよびバクテリアからアーキア膜脂質などイソプレノイドの生合成前駆体供給経路であるメバロン酸経路関連酵素の遺伝子を単離した。それらの酵素の一部は、近年我々が見出した変形メバロン酸経路に関与するものであり、それ以外の酵素も、古典的な真核生物型のメバロン酸経路に関与するものの、既知酵素とは大きく配列が異なっている。それらの遺伝子の大腸菌への導入によって、アーキア膜脂質をはじめとするイソプレノイドの生産を大幅に向上させることができると期待している。特に、バクテリア由来の一部酵素については、生成物によるフィードバック制御を受けないという予備的な結果が得られており、導入の効果が高いと予想される。
また、多様な構造のアーキア膜脂質の生産が大腸菌細胞膜に及ぼす影響の違いを調べるため、ヒドロキシアーキオールコアを持ったアーキア膜脂質の生産系を構築した。既知酵素のホモログ遺伝子を多様なアーキアから単離し、アーキア膜脂質生産大腸菌に導入することで、異なる種のアーキアから水和反応を触媒すると予想される酵素遺伝子を見出した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

大腸菌におけるアーキア膜脂質の生産量が低いことが最大の課題であり、その改善のためにプラスミドによるメバロン酸経路の導入や培地成分の検討などの対処を行った。その結果、アーキア膜脂質の生産量を向上させることには成功したが、それでも大腸菌内在性の膜脂質と比べるとアーキア膜脂質の生産量は少なく、細胞膜の物性や大腸菌のフェノタイプへの影響を安定に観察できていない。特に、アーキア膜脂質の高生産状態が不安定であり、培養を繰り返すと生産量が低下することが大きな問題となっている。今後は導入するメバロン酸経路遺伝子をバクテリアやアーキア由来のものに変えたり、遺伝子導入の手法を再検討するといった対策が必要だと思われる。
また、ヒドロキシアーキオールコアを持つアーキア膜脂質の生合成遺伝子については、いずれも既知の構造の膜脂質を生産するアーキアに由来するものであり、したがって当初期待していたような、構造の異なるヒドロキシアーキオール脂質の生合成遺伝子は単離できていない。

Strategy for Future Research Activity

大腸菌へのメバロン酸経路遺伝子群の導入を、プラスミドではなくゲノムへの相同組換えによって行い、アーキア膜脂質の安定した高生産を実現しようと考えている。大きな遺伝子断片のゲノムへの挿入は一般に難しいが、近年バクテリアのゲノム操作にも用いられるようになったCRISPR/Cas9システムによる実施例が報告されており、我々もこの手法を用いる予定である。酵母由来の遺伝子群と、バクテリア由来の遺伝子群それぞれの大腸菌ゲノムへの導入を予定している。
アーキア膜脂質の構造多様性の確保については、ヒドロキシアーキオールコアを持つ膜脂質以外にも、一般の膜脂質より炭化水素鎖が長いC25アーキオールコアを持つ膜脂質の生産を行おうと考えている。すでに一部生合成遺伝子の単離は行っており、今後既発表の方法と同様にして大腸菌における生産系を構築する。多様な構造のアーキア膜脂質を大腸菌において大量かつ安定に生産させることで、細胞膜の物性や大腸菌の表現系にどのような影響が出るかを多面的に観察していきたい。

Causes of Carryover

当初平成28年度のスタートを予定していた研究内容である、細胞膜の物性評価や大腸菌の表現系の検討に至る前に問題が生じ、その解決に時間がかかっている。そのため予算の未消化分が生じ、平成29年度に繰り越されることとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

繰り越した予算は当初平成28年度に予定していた膜の物性評価などの実験を平成29年度に開始するため、および新たに生じた課題である膜脂質の安定生産の実現を目的とした実験のために使用する。平成29年度分として請求した予算については、膜脂質の構造多様性の確保といった当初の予定通りの実験を実施するのに使用する。

  • Research Products

    (13 results)

All 2017 2016

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Acknowledgement Compliant: 2 results) Presentation (10 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] A single amino acid mutation converts (R)-5-diphosphomevalonate decarboxylase into a kinase2017

    • Author(s)
      Motoyama, K., Unno, H., Hattori, A., Takaoka, T., Ishikita, H., Kawaide, H., Yoshimura, T. & Hemmi, H.
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 292 Pages: 2457-2469

    • DOI

      10.1074/jbc.M116.752535

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Identification of enzymes involved in the mevalonate pathway of Flavobacterium johnsoniae2017

    • Author(s)
      Hayakawa, H., Sobue, F., Motoyama, K., Yoshimura, T. & Hemmi, H.
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 印刷中 Pages: 印刷中

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2017.04.120

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] 大腸菌をプラットフォームとしたアーキア膜脂質生合成研究2016

    • Author(s)
      邊見 久
    • Journal Title

      酵素工学ニュース

      Volume: 76 Pages: 11-15

  • [Presentation] 一アミノ酸置換によるメバロン酸3-キナーゼのジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼへの変換2017

    • Author(s)
      本山賢人、吉村 徹、邊見 久
    • Organizer
      2017年度日本農芸化学会大会
    • Place of Presentation
      京都女子大学
    • Year and Date
      2017-03-17 – 2017-03-20
  • [Presentation] Bacteroidetes門バクテリアFlavobacterium johnsoniaeのメバロン酸経路2017

    • Author(s)
      早川 祝、祖父江史明、吉村 徹、邊見 久
    • Organizer
      2017年度日本農芸化学会大会
    • Place of Presentation
      京都女子大学
    • Year and Date
      2017-03-17 – 2017-03-20
  • [Presentation] 非メバロン酸経路の中間体をドナー基質としたプレニル基転移酵素の反応2017

    • Author(s)
      林 佳史、伊藤智和、吉村 徹、邊見 久
    • Organizer
      2017年度日本農芸化学会大会
    • Place of Presentation
      京都女子大学
    • Year and Date
      2017-03-17 – 2017-03-20
  • [Presentation] Evolution of the mevalonate pathways in Archaea2017

    • Author(s)
      Hisashi Hemmi
    • Organizer
      2nd US-Japan Seminar on the Biosynthesis of Natural Products for Young Researchers
    • Place of Presentation
      東京工業大学
    • Year and Date
      2017-03-04 – 2017-03-05
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] アーキアにおけるメバロン酸経路の多様性とその進化2016

    • Author(s)
      邊見 久
    • Organizer
      第89回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      仙台国際センター
    • Year and Date
      2016-09-25 – 2016-09-27
    • Invited
  • [Presentation] 好熱性古細菌Thermoplasma acidophilum由来メバロン酸3-キナーゼの機能改変2016

    • Author(s)
      本山賢人、吉村 徹、邊見 久
    • Organizer
      第89回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      仙台国際センター
    • Year and Date
      2016-09-25 – 2016-09-27
  • [Presentation] 変異解析による好熱性アーキアSulfolobus solfataricus由来ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの反応機構の再検証2016

    • Author(s)
      本山賢人、川出 洋、吉村 徹、邊見 久
    • Organizer
      第26回イソプレノイド研究会例会
    • Place of Presentation
      長崎県立大学シーボルト校
    • Year and Date
      2016-09-20 – 2016-09-21
  • [Presentation] Conversion of 5-diphosphomevalonate decarboxylase into 3-kinase2016

    • Author(s)
      Hisashi Hemmi, Kento Motoyama, Ai Hattori, and Tohru Yoshimura
    • Organizer
      The 5th International Conference on Cofactors and Active Enzyme Molecule 2016
    • Place of Presentation
      黒部市宇奈月国際会館
    • Year and Date
      2016-09-04 – 2016-09-08
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 好熱性アーキア由来ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異解析2016

    • Author(s)
      本山賢人、吉村 徹、邊見 久
    • Organizer
      平成28年度日本生物工学会中部支部例会
    • Place of Presentation
      名古屋大学
    • Year and Date
      2016-08-05 – 2016-08-05
  • [Presentation] 好熱性アーキアSulfolobus solfataricus由来ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの耐熱性に寄与するサブユニット間ジスルフィド結合2016

    • Author(s)
      邊見 久、服部愛、海野英昭、郷田秀一郎、本山賢人、吉村徹
    • Organizer
      日本Archaea研究会第29回講演会
    • Place of Presentation
      東洋大学
    • Year and Date
      2016-07-07 – 2016-07-08

URL: 

Published: 2018-01-16  

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