2017 Fiscal Year Research-status Report
特殊環境微生物由来テーラーメード膜小胞を用いた低温膜タンパク質生産系の開発
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16K14885
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
川本 純 京都大学, 化学研究所, 助教 (90511238)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Psychrophile / Outer membrane vesicle / Shewanella |
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| Outline of Annual Research Achievements |
回遊性魚類の腸管より採取されたグラム陰性細菌 Shewanella sp. HM13 は、近縁の Shewanella 属細菌に比べて菌体外膜小胞 (Extracellular membrane vesicles, EMV) 生産能に秀でた低温適応細菌である。本菌においては、機能未知の膜タンパク質 P49 が EMV のほぼ単一の積み荷タンパク質として菌体外に輸送される。本菌の選択的な P49 の EMV 輸送機構の解明を目的に、本菌の全ゲノム配列を解析した。P49 をコードする遺伝子 HM3347 は、グラム陰性細菌の II 型タンパク質輸送装置 (T2SS) のホモログで構成されるタンパク質輸送装置と、表層リポグリカン生合成タンパク質をコードする遺伝子群で構成される遺伝子クラスターに存在した。HM3347 の上流に存在する T2SS 関連遺伝子を破壊した結果、P49 の大部分は細胞内に蓄積していた。T2SS 関連遺伝子の内、外膜チャンネルドメイン GspD2 を欠損する変異株を用いて、当該遺伝子の相補株を作製した結果、P49 の EMV への組み込みが回復したことから、HM3347 の上流遺伝子群でコードされる T2SS 様タンパク質輸送装置が、P49 の菌体外膜への移行を担うことが示された。一方で、HM3347 の下流遺伝子でコードされる表層リポグリカン合成タンパク質群を欠損させた結果、P49 は細胞外に輸送されたものの、EMV には組み込まれていなかったことから、これらのタンパク質群は、細胞表層における P49 の EMV への組み込みに関与していることが示唆された。以上の結果から、本菌における P49 の選択的な EMV への組み込みには、T2SS 様タンパク質輸送装置による細胞表層への移行と、表層リポグリンカンの生合成が協調して進行することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、Shewanella sp. HM13 の有する選択的な膜タンパク質の EMV 輸送能を積極的に活用した成熟型膜タンパク質の分泌生産系の開発を目指している。本菌を活用した膜タンパク質生産機構の開発には、本菌の P49 選択的な EMV 輸送能の分子基盤の解明が必須である。現在までに、本菌の全ゲノム解析と周辺遺伝子群の破壊実験から、P49 の選択的の EMV の組み込みには、グラム陰性細菌の II 型タンパク質輸送装置様タンパク質群による菌体表層への移行と、表層リポグリカン生合成タンパク質群による菌体表層構造のリモデリングの協調によって進行することが明らかとなった。以上のように、本菌の積極的な活用を目指した選択的な膜タンパク質輸送機構に関する分子機構を明らかに、概ね順調に推移しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
Shewanella sp. HM13 による EMV を介した P49 の選択的な菌体外輸送機構を詳細に解析するために、周辺遺伝子でコードされるタンパク質群の生化学的解析を行う。特に、T2SS 様タンパク質輸送装置における基質結合ドメインと予想される GspE2、および P49 遺伝子の下流にコードされる Wzx フリッパーゼ (Wzx)、Lipid A ホスフォエタノールアミントランスフェラーゼ (LptA)をそれぞれ精製し、GspE2については P49 との結合能、Wzx と LptA については、修飾様式やアシル鎖組成の異なる様々な Lipid A に対する輸送能、および多少酵素との結合能を評価する。以上の実験を通して、P49 選択的な EMV 輸送に関する分子基盤の詳細を明らかにする。併行して、P49 遺伝子に緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を融合し、P49 の EMV への組み込みに関与するシグナルアミノ酸配列を解析する。
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| Causes of Carryover |
本年度の遺伝子破壊実験の結果、本研究で対象とする Shewanella sp. HM13 の選択的膜タンパク質輸送は II 型タンパク質輸送装置と表層リポグリカンのリモデリング機構の協調によって進行することが示唆された。このような表層リポグリカンのリモデリングと協調したタンパク質輸送機構は、従来のグラム陰性細菌のタンパク質輸送経路では報告例のない新規のタンパク質輸送経路であることが示唆されている。本研究課題で目標とする本菌の選択的タンパク質輸送機構を応用した異種膜タンパク質生産システムの開発には、本実験より明らかとなった新規のタンパク質輸送に関わる分子基盤の詳細を解明することが必須であり、次年度使用額が生じることとなった。次年度では、本タンパク質輸送に関わるタンパク質群の生化学的諸性質を解析し、タンパク質輸送の詳細を解析する。
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