2016 Fiscal Year Research-status Report
糸状菌の遺伝子組換えを革新的に変えるマルチコピー遺伝子導入法の開発
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16K14887
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
若井 暁 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命准教授 (50545225)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 分子生物学 / 糸状菌 / マルチコピー / 多重遺伝子破壊 / 多重遺伝子導入 / 次世代シーケンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
麹菌Aspergillus oryzaeでは、分子ツールが潤沢でないため遺伝子工学的な改変に多くの制限と多大な時間と労力を要する。一方で、A. oryzaeでは、染色体上に非相同的に組み込むコトランスフォーメーションによりマルチコピーで遺伝子導入が可能であることが知られている。本研究では、コトランスフォーメーションにおける染色体上遺伝子導入部位偏重を解析し、新しいマルチ遺伝子破壊法や多種類遺伝子の同時導入法開発を目指す。
(1)次世代シーケンス解析による導入部位の特定：コピー数の多形性と遺伝子導入部位の関係性を探るために、同一導入遺伝子に対して三つの異なるプロモーター/ターミネーターのセットを用意して形質転換を行い、合計9株の形質転換体を作成した。これらの形質転換体の染色体上のコピー数を確定するために、プローブ法による定量PCRを行った。従来の傾向の再現性を取り、9株中4株についてMiSeqを用いたリシーケンスを行った。今後、残りの5株のリシーケンスを行う。
(2)マルチコピー遺伝子導入株を足場とした相同組み換えを利用した部位特異的遺伝子導入：ligD遺伝子破壊株は相同組換え効率が上昇することが知られている。そこで、既に構築してあるマルチコピー遺伝子導入株について、従来法に従ってligD遺伝子を破壊し、ligD遺伝子破壊セルラーゼマルチコピー遺伝子導入株（MultiCelΔligD株）を得た。今後、この株を宿主として部位特異的外来遺伝子の再導入を行う。
(3)非相同的組換えにおける導入部位偏重の解析：(1)および(2)の実験に想定外に時間を要したため、形質転換体構築の時間を利用して、H29年度予定分を前倒しして導入遺伝子の末端配列を任意配列にした形質転換体を行い、複数の形質転換体を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の目標として、(1)および(2)の実験項目について以下を掲げていた。(1)次世代シーケンス解析による導入部位の特定：コピー数多形性の異なる9株についてコピー数を決定し、ゲノムリシーケンスを行う。(2)マルチコピー遺伝子導入株を足場とした相同組み換えを利用した部位特異的遺伝子導入：既に構築してあるマルチコピー遺伝子導入株について、従来法に従ってligD遺伝子を破壊する。
実際の進捗状況として、下記の通りとなっており、順調な部分と、遅れている部分、逆に前倒しで進めている部分があるため、トータルでみておおむね順調に進展していると自己評価を行った。
(1)次世代シーケンス解析による導入部位の特定：コピー数多形性の異なる三つのプロモーター/ターミネーターセットを用いて9株の形質転換体を取得し、それぞれの株についてプローブ法による定量PCRにより、染色体上の導入遺伝子コピー数を決定した。この内、約半分の4株についてリシーケンスを行ったが、残りの5株について未実施となっている。
(2)マルチコピー遺伝子導入株を足場とした相同組み換えを利用した部位特異的遺伝子導入：予定通りligD遺伝子破壊セルラーゼマルチコピー遺伝子導入株（MultiCelΔligD株）を構築した。
一方で、(1)および(2)の形質転換体の取得に想定外の時間を費やしたため、遅い生育速度の合間を利用して、平成29年度実施予定の(3)非相同的組換えにおける導入部位偏重の解析を前倒しで実施した。導入遺伝子断片の末端に任意の配列を持ち鎖長の異なる配列を付加して形質転換を実施した。長すぎる鎖長や短すぎる鎖長では、これまでの形質転換体の取得し易さの傾向と異なってきており、末端配列の重要性が示唆されつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度は、下記三つの項目について実験を実施する。
(1)次世代シーケンス解析による導入部位の特定：コピー数多形性の異なる三つのプロモーター/ターミネーターセットを用いて作成した9株の形質転換体の内、リシーケンスが未実施の5株についてリシーケンスを行う。全9株について、詳細なマッピング解析等を実施し導入部位を特定する。マッピング解析によるコピー数と定量PCRによるコピー数が一致しない場合には、Inverse PCR cloning等の従来手法を用いて補償を取る。
(2)マルチコピー遺伝子導入株を足場とした相同組み換えを利用した部位特異的遺伝子導入：ligD遺伝子破壊セルラーゼマルチコピー遺伝子導入株（MultiCelΔligD株）を宿主として、染色体上の相同多重配列を標的として相同組換えを行い、目的遺伝子の多重遺伝子導入について検討を行う。形質転換時には、物質生産（乳酸）を担う遺伝子を利用し、染色体上コピー数の確認だけでなく、物質生産能への影響を検討する。具体的にはベクターインテグレーション法で作成したシングルコピー株と乳酸生産量を比較する。
(3)非相同的組換えにおける導入部位偏重の解析：平成28年度に前倒しで作成した形質転換体について、染色体上の導入遺伝子コピー数を定量PCRにより解析する。これとは別に、(1)で特定した染色体上の遺伝子導入部位の上流・下流配列を抽出し、導入部位間の相同性あるいはクラスター解析を行う。以上の結果を組み合わせて、使用した配列および鎖長と多形性についての関係性を調査し、遺伝子導入部位特定に関連する最低ユニットの配列（非相同組換え認識配列）を絞り込む。
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