2016 Fiscal Year Research-status Report
リン酸を利用できない生命体の構築：リンのコントロールによる遺伝子組換え体封じ込め
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16K14889
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
廣田 隆一 広島大学, 先端物質科学研究科, 助教 (90452614)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 生物学的封じ込め / 亜リン酸 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者はこれまでに微生物のリン代謝について研究を進めてきた。その過程で、一部のバクテリアに還元された形態のリンを利用する能力が存在することに着目した。還元型リンは環境中には存在しないため、目的とする組換え体に還元型リンの資化能力を付与し、リン酸の利用能力を欠如させることができれば、その生物は環境中では生育することができない。すなわち生命の必須元素であるリンのコントロールによって組換え体の封じ込めが可能になると考えた。一方、様々な微生物のリン輸送体の解析を行っていたところ、このコンセプトを実現するために必要な性質と合致した機能を持つリン輸送体HtxBCDEを発見した。この輸送体と亜リン酸デヒドロゲナーゼ（PtxD)を大腸菌に発現させ、内在性のリン酸輸送体およびリン酸エステル輸送体の遺伝子を破壊したところ、完全に増殖を亜リン酸に依存するRN1008株を作製することに成功した。RN1008株の様々な培地における増殖を調べたところ、2xYT培地やその他のいかなる培地においても、増殖を示さないことが明らかになった。さらに、逃避確率（封じ込めから逃れる確率）は10-13以下であり、当初の目的であった米国国立衛生研究所（NIH）の基準である10-8を大きく下回った。つまり、本手法による封じ込め効果は極めて高く、当初予想した以上の結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
初年度で、予定していたリンの代謝経路改変による封じ込め手法のコンセプトを実現でき、その評価も終了した。さらに、本手法の封じ込め効果は当初の予想を上回るものであった。
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| Strategy for Future Research Activity |
リン酸、亜リン酸、次亜リン酸の構造は類似性があるにもかかわらず、リン酸がHtxBCDを透過できないのは、結合タンパク質による基質認識の違いに起因すると考えられる。そこで、3つのリン輸送体のBPであるPstS、PtxB、HtxBの組換えタンパク質を作製し、リン酸、亜リン酸、次亜リン酸との結合をリンの結合実験により調べる。
また、作製した封じ込め株E. coli RN1008は、亜リン酸が存在しても複合培地に対する感受性を示すことが明らかになっており、その原因を解明する。さらに、この感受性をサプレッスする変異株からは、逃避変異株の出現が確認されており、その逃避メカニズムの解明を行う。
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[Journal Article] A Novel Biocontainment Strategy Makes Bacterial Growth and Survival Dependent on Phosphite2017
Author(s)
Ryuichi Hirota, Kenji Abe, Zen-ichiro Katsuura, Reiji Noguchi, Shigeaki Moribe, Kei Motomura, Takenori Ishida, Maxym Alexandrov, Hisakage Funabashi, Takeshi Ikeda, Akio Kuroda
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 7
Pages: 44738
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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