2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K14898
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
田中 俊之 筑波大学, 生命環境系, 教授 (10217052)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 酵素 / タンパク質発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放線菌由来の抗腫瘍性抗生物質ネオカルチノスタチン（NCS）の活性本体であるクロモフォアの９員環エンジイン骨格には炭素間三重結合が２つあり、その生合成には、１２種類の酵素が関与すると考えられている。今年度は、昨年度構築した大腸菌を用いた発現系を用い、大量発現と精製法の確立を試みた。その結果、７種類の酵素に関して、純度の高いタンパク質を得ることが出来たが、その他については、発現量や安定性が低く、今後、発現系の構築も視野に入れ、再検討する予定である。調製出来た酵素については、その三次元構造解析のため、結晶化の検討を開始した。
炭素間三重結合を有するクレペニン酸を産生する植物２種を、種子から育て、新鮮な植物体を得た。その葉をMilli-Q水で洗浄後、適当な大きさに裁断し、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉末状にした。これを材料として、DNeasy Plant Mini Kitを用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを用い、各酵素のDNA配列に基づき設計したプライマーを用いてPCRを行った。得られたPCR産物から、TAクローニング等により目的とする酵素をクローニングした。これらを、タンパク質の発現に用いるベクター数種(pETなど)に入れ替え、それぞれ適当な大腸菌数種に導入した後、該当するインダクション法により、酵素タンパク質を誘導発現させた。その結果、一定量のタンパク質を発現させることに成功した。今後は、適当な精製法を確立し、構造解析のために大量のタンパク質を調製する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
昨年度、クレペニン酸を産生する植物については、新鮮な植物体を得ることが出来ず、種子から栽培する必要が生じたため、当初の予定から遅れが生じた。今年度は、兼務している専攻長の業務量が想像以上に増加したため、研究に取り組む時間を充分に取ることが出来ず、その遅れを取り戻すどころか、環状エンジイン骨格合成酵素も含め、全体の研究に遅れが生じてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
既に発現系が構築出来た環状エンジイン骨格合成酵素と鎖状不飽和脂肪酸（クレペニン酸）アセチレナーゼに焦点を絞り、それらの三次元構造解析を進める。また、国内で採取出来る植物や微生物を対象とした新奇アセチレナーゼの探索を続ける。
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| Causes of Carryover |
現在までの進捗状況にも記載したが、研究が、全体的に、当初の予定から遅れているため、次年度使用額が生じた。
環状エンジイン骨格合成酵素の結晶化のための消耗品類を購入する。また、クレペニン酸の合成に関わるアセチレナーゼについては、大量発現系と効率良い精製方法の確立に必要な消耗品や実験器具類を購入する予定である。
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