2016 Fiscal Year Research-status Report
カイコから４種血清型デングウイルスに対応した４価ウイルス様粒子ワクチンの開発
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16K14900
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
朴 龍洙 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 教授 (90238246)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ウイルス / デング熱 / ウイルス様粒子 / カイコ / バクミド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デング熱は、デングウイルス（以下「DENV」）が原因の感染症であり、現在実用化されているワクチンはない。本研究では、申請者が独自で開発してきた先駆的バクミド技術を基盤とし、デングウイルス様粒子（Dengue virus-like particle、以下「DENV VLP」）の表面上に多価抗原を提示させるため、下記の研究を行った。
１．DENV VLP発現用バクミドの作製とカイコでの発現：DENV VLPの形成に必要なPrMとEを用いた。異なる血清型のDENV株RNAから逆転写反応でDNAを得て、それぞれの血清型のPrM-E1～PrM-E4の配列をPCRで増幅し、ポリへドリンプロモーターの下流に分泌用Bxシグナル配列、精製用タグ及びPrM-E1～PrM-E4を連結し、pFastbac1にクローニングした。一方、各血清型のVLPの発現を検出するために、それぞれ異なる精製用タグ（FLAG,HIS,Strep,PA）を使用した。pFastbac1をE. coli Bm DH10Bacに形質転換し、組換えBombyx mori nucleo-polyhedrovirus (BmNPV)バクミドを作製し、BmNPV /PrM-E1、-E2、-E3、－E4 bacmidと命名した。
２．カイコでDENV VLPの発現：得られたバクミドを5齢カイコに注射し、4～7日間飼育した後、カイコから体液を回収し、それぞれのバクミドを単一発現させると、血清型１、２、３、４の４種類の単価DENV VLPが得られる。この発現系を検証するために、血清型1種類について調べたところ30 kDaのみ確認され、PrM-E全長ではなかった。
上記の結果から、発現ベクター及び発現系の再確認を行う必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
一遍に4血清型のウイルス様粒子作製を進めたので、トラブルシューティングができなくなり、結果的に原因把握ができなくなった。次年度にはバクミド作製を再確認し、発現をやり直す必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
2年目には、
１．前年度の発現系を再確認し、4血清型DENV VLPを発現する。
２．DENV VLPの精製：単一発現の場合、前処理用イオン交換カラム（GigaCap）を用いてカイコ体液に含まれている核酸やイオン性夾雑物を除去した後、それぞれのタグでアフィニティクロマト精製を行い、核酸とバキュロウイルスを含まない単価DENV VLPを得る。共発現の場合、前述のように核酸とイオン性夾雑物を除去した後、異なるアフィニティ法を採用し、ウイルスフリーの４価DENV VLP（DENVE1-4 VLP）を得る。この手法で得られる２価、３価、４価DENV VLPの発現を定量化する。
３．４価DENV VLPの確認と形状解析：４種類のタグ抗体を用いてウエスタンブロットを行いPrM-E1～E4の発現を確認する。透過型電子顕微鏡や免疫電子顕微鏡を用いて、それぞれDENV VLPの形状解析やVLP表面上に提示された４種の血清型（E1～E4）を確認する。また、動的散乱法による粒子径測定を行い、１価～４価DENV VLPの直径を測定する。
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