Development of sensitive biosensors which detectable multi-heavy metal by applying phytochelatin synthase

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K14902
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 村岡 未彩 大阪大学, 薬学研究科, 特任助教(常勤) (00707614)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 感度向上 / キャラクタリゼーション / γ-EC生産

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、主にカドミウム(Cd)によって強く活性化される高等植物由来フィトケラチン合成酵素(PCS)をセンサー素子として、多様な有害重金属の検出が可能な高感度バイオセンサーを開発することを目的としてきた。すでに我々は、酵母表層提示PCSを素子とした場合に0.02 mg/LのCdを検出できることを明らかにしているが、環境水のモニタリングに適用するためには、0.003 mg/Lの感度が必要となる。本研究では、精製組換えAtPCS1を用いてCd検出条件の最適化を行った結果、キレート剤による前処理により、感度を約0.001 mg/Lまで高めることに成功した。さらなる高感度化を目指し、基質であるグルタチオン(GSH)に真核生物由来PCSより高い親和性を有するラン藻由来NsPCS配列とAtPCS1のＣ末端配列を組み合わせた融合酵素を作成したが、感度の上昇はみられなかった。さらに、AtPCS1に点変異を導入した場合も、感度、金属特異性に有意な変化はみられなかった。そのため、期間内でのさらなる高感度化ならびに金属特異性を変化させることを断念し、残りの期間で精製NsPCSの酵素学的解析を行った。その結果、反応に用いる緩衝液の濃度・種類によって反応速度が数倍上昇することを見出した。NsPCSはGSHからGlyを切り出し、γ-GluCys(γ-EC)を生成する酵素である。γ-ECは、近年神経保護や血管内投与により脳内GSH濃度を上昇させることが明らかとなり、その有用性が着目されているが、現在用いられているglutamate-cysteine ligase(GCL)による製造方法では高コストという問題点がある。本研究により、溶解度に近い高濃度GSHを数時間で完全にγ-ECに変換することが示され、本反応系が新たな低コストな製造方法として期待できることが示された。